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IMPROVED METHOD FOR AMPLIFYING ATP AND UTILIZATION THEREOF meetings achieved

Patent code P110003191
File No. K053P68
Posted date Jun 17, 2011
Application number P2003-202992
Publication number P2005-046010A
Patent number P4431334
Date of filing Jul 29, 2003
Date of publication of application Feb 24, 2005
Date of registration Dec 25, 2009
Inventor
  • (In Japanese)黒田 章夫
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title IMPROVED METHOD FOR AMPLIFYING ATP AND UTILIZATION THEREOF meetings achieved
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for an assay with ultrahigh sensitivity by which the presence of one microorganism can be detected.
SOLUTION: A trace amount of an exogenous ATP is amplified and detected by using a method for amplifying the ATP by which a mixture containing the ATP, AMP and a polyphosphate compound is made to react with a fusion protein (PKK-ADK) between a polyphosphate kinase and an adenylate kinase without containing the ADP. The method for amplifying the ATP with the ultrahigh sensitivity by which the ATP at the level of one cell can be amplified and detected is provided. The method for the microbioassay with the ultrahigh sensitivity based on the method for amplifying the ATP is provided.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


迅速かつ高感度で微生物を検出する方法は、例えば、食中毒予防のための食品製造工場における微生物の検出などの環境微生物の制御、食品(例えば、ミルクなどの乳製品)における微生物の混入の検査など、食品業界、酪農業界などにおいて非常に重要である。従来の栄養培地を用いて生細胞を検出する方法においては、生存微生物をカウントするまでに数日を要する。



このような微生物の検出に、全ての生物に存在するATPを利用する方法が検討されている。ATPを検出する方法として、ホタルルシフェラーゼを用いる生物発光アッセイが知られている。この方法は、ATPを測定する確立された方法であり(非特許文献1参照)、迅速な衛生学的なモニタリングとして用いられている(非特許文献2)。さらに、最近ではバイオテロに対する対抗技術として、ATPアッセイが提案されている(非特許文献3)。



しかし、従来のATPのアッセイ法には検出限界(例えば、約104大腸菌コロニー形成単位(CFU)/アッセイ)がある。この感度では、工業的な応用には充分な感度とはいえない。



コンピューターシュミレーションでは、アデニレートキナーゼ(ADK)およびピルビン酸キナーゼ(PVK)を用いるATP増幅は、高感度の光度計を用いなくとも、非常に低いレベルのATPを検出し得る可能性があることが示唆されている(非特許文献4)。しかし、この方法は、実際に行われていない。



微量のATPをアッセイするために、ATPを増幅させる方法が提案されている(特許文献1)。この特許文献1に示される方法を図1で説明する。図1において、ADKはアデニレートキナーゼ(adenylate kinase)、polyPはポリリン酸(polyphosphate)、PPKはポリリン酸キナーゼ(polyphospate kinase)を意味する。以下、本明細書においても、この略号を使用するときがある。図1aは、ATPの非存在下では、理論的には、AMPとポリリン酸とからはATPが生成しないことを示している。図1bに示すように、ATPが存在すると、ADKによって、ATPからAMPへのリン酸基転移反応が起こり、2分子のADPが生成する(第1反応)。この第1反応で生じた2分子のADPは、PPKの作用により、ポリリン酸からリン酸基を受け取り、2分子のATPを生じる(第2反応)。この第2反応で生じた2分子のATPは、再度、第1反応に使用され、4分子のADPを生成し、この4分子のADPはPPKによって4分子のATPに変換される。



このように、特許文献1では、過剰のAMPとポリリン酸を存在させて、ADKとPPKの平衡状態をそれぞれ、ADP生成方向(第1反応)およびATP生成方向(第2反応)に向かわせるようにし、第1反応と第2反応を1つの反応系として、n回この反応系を繰り返すことにより、1個のATPが2n個に増幅される。従って、この方法は、優れたATPの増幅方法である。



この特許文献1の方法は、従来のレベルよりも高い感度で、細胞の存在を検出し得る点では優れた方法であるが、この方法では、理論的には起こらないATP非存在下でのATPの増幅が、低いレベルであるが、時折見られることが判明し、外因性の(外部から添加した)ATPのみを増幅し、検出するという確実性に欠けるという問題がある。すなわち、細胞1個のレベルのATPを増幅し、検出し得るまでの感度を確実に提供できないという問題がある。さらに、ADKとPPKとの活性の調整などの問題もある。



【特許文献1】
特開2001-299390号公報
【非特許文献1】
デルカおよびマッケルロイ(DeLuca, M. and W. D. McElroy. )「Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions」 Biochemistry 26巻、921-925頁(1974年)
【非特許文献2】
バウティスタ(Bautista, D. A.)ら、「Adenosine triphosphate bioluminescence as a method to determine microbial levels in scald and chill tanks at a poultry abattoir」 Poult. Sci. 73巻、1673-1678頁(1994年)
【非特許文献3】
スペンサーおよびライトフット(Spencer, R. C. and N. F. Lightfoot) 「Preparedness and response to bioterrorism」 J. Infect. 43巻104-110頁(2001年)
【非特許文献4】
チトック(Chittock, R. S.)ら、「Kinetic aspects of ATP amplification reactions」 Anal. Biochem 255巻、120-126頁(1998)
【非特許文献5】
アキヤマ(Akiyama, M.)ら、「The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein」 J. Biol. Chem. 267巻、22556-22561頁(1992年)
【非特許文献6】
ブルーン(Brune, M.)ら、「Cloning and sequencing of the adenylate kinase gene (adk) of Escherichia coli」 Nucleic Acids Res. 13巻、7139-7151頁(1985年)
【非特許文献7】
ニューハード J、およびY.ニガード(Neuhard, J., and Y. Nygaard) 「Purines and pyrimidines」 445-473頁、ネイドハルト(F. C. Neidhardt)ら編、 Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, ASM press, Washington, D. C. (1987年)
【非特許文献8】
ネイドハルト(F. C. Neidhardt) 「Chemical composition of Escherichia coli」 3-6頁、ネイドハルト(F. C. Neidhardt)ら編、 Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology」 ASM press, Washington, D. C.(1987年)
【非特許文献9】
ベルト(Bert, F.)ら、「Multi-resistant Pseudomonas aeruginosa outbreak associated with contaminated tap water in a neurosurgery intensive care unit」 J. Hosp. Infect. 39巻、53-62頁(1998年)
【非特許文献10】
オルソン(Olsson, T.)ら、「Extraction and determination of adenosine 5'-triphosphate in bovine milk by the firefly luciferase assay. Biotech」 Appl. Biochem 8巻、361-369頁(1986)

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、ATPの増幅方法および該方法を用いて微生物の存在を迅速に検出する方法、並びのそのためのキットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ATP、AMPおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、N末端側から順にポリリン酸キナーゼ-アデニレートキナーゼを有しかつADP除去処理が施された融合タンパク質を作用させる工程を含み、該ADP除去処理が、アピラーゼ処理およびピロリン酸処理を含む、ATPの増幅方法。

【請求項2】
 
ATP、AMPおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、N末端側から順にポリリン酸キナーゼ-アデニレートキナーゼを有しかつADP除去処理が施された融合タンパク質を作用させて、ATPを増幅する工程;および、該増幅したATPを検出する工程;を包含し、該ADP除去処理が、アピラーゼ処理およびピロリン酸処理を含む、ATPの検出方法。

【請求項3】
 
微生物の存在を迅速に検出する方法であって、
微生物含有試料を処理して、ATP含有試料を調製する工程;
該ATP含有試料をATP増幅系に添加してATPを増幅する工程;および、
該増幅したATPを検出する工程;を包含し、
該ATP増幅系がAMP、ポリリン酸化合物、およびN末端側から順にポリリン酸キナーゼ-アデニレートキナーゼを有しかつADP除去処理が施された融合タンパク質を含み、
該ADP除去処理が、アピラーゼ処理およびピロリン酸処理を含む、方法。

【請求項4】
 
微生物の存在を迅速に検出するためのキットであって、AMP、ポリリン酸化合物、およびN末端側から順にポリリン酸キナーゼ-アデニレートキナーゼを有しかつADP除去処理が施された融合タンパク質、を含有するATP増幅試薬と、ATPを検出するATP検出試薬とを包含し、該ADP除去処理が、アピラーゼ処理およびピロリン酸処理を含む、キット。

【請求項5】
 
さらに細胞溶解用試薬を備える、請求項4に記載のキット。

【請求項6】
 
N末端側から順にポリリン酸キナーゼ-アデニレートキナーゼを有しかつADP除去処理が施された融合タンパク質であって、該ADP除去処理が、アピラーゼ処理およびピロリン酸処理を含む、融合タンパク質。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) PRESTO Conversion and Control by Advanced Chemistry AREA
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