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BIOMOLECULE ASSAY CHIP

Patent code P110003815
File No. AF12P006
Posted date Jun 30, 2011
Application number P2006-297267
Publication number P2008-116218A
Patent number P5187932
Date of filing Nov 1, 2006
Date of publication of application May 22, 2008
Date of registration Feb 1, 2013
Inventor
  • (In Japanese)根本 直人
  • (In Japanese)一木 隆範
  • (In Japanese)マニッシュ ビヤニ
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title BIOMOLECULE ASSAY CHIP
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of constructing a biomolecule assay chip by using microreactor techniques and a chip thus constructed.
SOLUTION: A method of constructing the chip having biomolecules having been immobilized in an aligned state thereon, which comprises (a) a step of preparing a substrate 1 wherein a plural number of biomolecules 1 of a single type are immobilized in an aligned state; (b) a step of adding a reaction reagent for synthesizing biomolecules 2 in microreactors of a microreactor chip, that has the microreactors at positions overlapping the positions of the aligned biomolecules 1 that has been immobilized on the substrate 1 which is prepared in step (a); (c) a step of closely attaching the reaction reagent for synthesizing the biomolecules 2 to the substrate 1 so as to bring it into contact with the biomolecules 1, thereby synthesizing the biomolecules 2 in the microreactors; and (d) after the completion of step (c), a step of overlaying the microreactor chip on a substrate 2 so as to bond the biomolecules 2 to the substrate 2. The chip constructed by this method is provided.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

生体分子を網羅的に解析する有力なツールとして、DNAチップやプロテインチップなどが現在利用されている。これらのチップは、DNA、タンパク質を基板上にアレイ状に固定化し、目的に応じた反応系に供することで、目的の機能を発揮する可能性のある分子の同定を網羅的に行うことができる。

DNAチップに関しては、光リソグラフィー技術を用いてチップ上にDNAを合成することで位置情報と配列情報を対応させるアフィメトリックス社の方法とすでに既知の配列をもったDNAをチップ上に貼り付けるスタンフォード大方式が現在多く利用されている。大規模な配列を一度に調べるにはアフィメトリックス方式が有利で、ある限られた既知の配列のDNA集団を調べるにはスタンフォード方式が便利である。これらの方法は目的に応じて使い分けられている。

また、プロテインチップの作製に関しては、Phylos社による、アフィメトリックス型のDNA基板にIVV(in vitro virus)のmRNA領域をハイブリダイゼーションさせてチップ上にタンパク質を番地化して非共有結合的に固定化する試み(非特許文献1)があるもののその多くは、特定の限られたタンパク質集団をスポットしてチップ化するスタンフォード方式のプロテインチップである。このため未知の配列からなる遺伝子を元にした膨大なライブラリからプロテインチップを作製することは極めて困難な状況である。ちなみに、Phylos社の方法はこの点でもっとも有望であるが、タンパク質の固定化にハイブリダイゼーションによる方法を用いていることから、様々なバッファー条件下で酵素アッセイをする目的に対しては、安定な固定化法とは言えず、未だ実用的な段階には至っていない。さらに、ハイブリダイゼーションさせる領域をタグとして導入するプロセスを加えることになるため実用性の上から必ずしも効率的とは言えない。

一方、発明者らは、IVV(in vitro virus)法を利用した、有用タンパク質の同定、開発に関し、種々の技術を提供している(特許文献1)。IVV法とは、ランダムな配列を有する多量のペプチド又は該ペプチドからなるペプチドライブラリーの中から、目的に応じたペプチド分子を選択する方法で、進化工学上、有力な手法として注目を浴びている。IVV法は、核酸配列情報とこれに対応するタンパク質の活性又は機能を、1対1で対応づけることができる技術であるため、本法を網羅的解析に利用することができれば、所望の活性を有するタンパク質とこれをコードする核酸配列情報を同時に、かつ、大量に取得することも可能となる。しかしながら、現段階では、このような方法により網羅的な解析を可能にする技術等は報告されていない。

【非特許文献1】
Wengら,Proteomics.2:48-57,2002
【特許文献1】
国際公開公報WO2006/041194

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、生体分子を配列状に固定化したチップに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
下記の工程(a)~(e)を含む、タンパク質-核酸複合体が配列状に固定化されたチップの作製方法。
(a)複数のDNAを配列状に固定化した基板1を作製する工程、
(b)工程(a)で作製した基板1上に固定化されたDNAの配列位置と重なる位置に微小リアクターを具備するマイクロリアクターチップにおいて、該微小リアクター内に、mRNAを合成するための反応試薬を充填する工程、
(c)mRNAを合成するための反応試薬がDNAと接触するように、マイクロリアクターチップと基板1を密着させ、微小リアクター内でmRNAを合成する工程、
(d)工程(c)を終了したマイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板2と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板2を重ね合わせ、mRNAを該基板2上に固定する工程、
(e)工程(d)においてRNAを固定した基板2上に、該mRNAからタンパク質を合成する反応液を添加し、該mRNAからタンパク質を合成する反応を行わせる工程

【請求項2】
 
請求項1の工程(a)に記載の「複数のDNAを配列状に固定化した基板1」を作製する工程が、下記の工程(a)~(c)を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
(a)DNADNAを増幅するための反応試薬との混合液を、マイクロリアクターチップの微小リアクター内に、DNAが確率分布的に1分子以下になるように希釈して充填する工程、
(b)DNAを増幅する反応を行う工程、
(c)該マイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板1と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板1を重ね合わせ、増幅したDNAを基板上に固定する工程

【請求項3】
 
前記DNAを増幅する反応がポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする請求項2に記載の方法。

【請求項4】
 
前記DNAがリンカーDNAを連結したものであることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
 
前記リンカーDNAにピューロマイシンが結合していることを特徴とする請求項4に記載の方法。

【請求項6】
 
前記基板1上にアビジンを固定化し、前記DNAをビオチン化することを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の方法。

【請求項7】
 
前記基板2にピューロマイシンを結合したリンカーDNAを介して前記mRNAが固定化されていることを特徴とする請求項1乃至6のいずれかに記載の方法。

【請求項8】
 
前記mRNAからタンパク質を合成する反応溶液が無細胞翻訳系を含有する溶液であることを特徴とする請求項1乃至7のいずれかに記載の方法。

【請求項9】
 
mRNAからタンパク質を合成する反応を行わせた後、該基板2上にさらに逆転写酵素を含む反応液添加し、該mRNAからDNAへの逆転写反応を行わせるこを特徴とする請求項8に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2006297267thum.jpg
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Establishment of Innovative Manufacturing Technology Based on Nanoscience AREA
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