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METHOD FOR REFINING RNA EXTRACTED FROM SOIL achieved

Patent code P110004041
File No. A181P211
Posted date Jul 5, 2011
Application number P2007-255921
Publication number P2009-082066A
Patent number P5277497
Date of filing Sep 28, 2007
Date of publication of application Apr 23, 2009
Date of registration May 31, 2013
Inventor
  • (In Japanese)頼 泰樹
  • (In Japanese)大塚 重人
  • (In Japanese)中西 友子
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
  • (In Japanese)国立大学法人東京大学
Title METHOD FOR REFINING RNA EXTRACTED FROM SOIL achieved
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To develop a method for refining RNA by removing impurities therein to the utmost.
SOLUTION: The method for refining RNA comprises: a first step of preparing an RNA solution by adding cetyltrimethylammonium bromide(CTAB) to an RNA extract liquid, and a second step of retrieving RNA from the RNA solution in the presence of polyethylene glycol.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

植物内における本来の物質動態を知るためには、植物におけるイメージングを行う際の環境がその植物にとっての本来の生育環境に近似していることが重要である。植物にとっての本来の生育環境を知るためには、植物が生育する土壌についての情報を解析する、優れた技術が不可欠である。植物の生育に大きな影響を与える要因としては、土壌のpH、無機塩類濃度といった土壌の理化学性に加え、植物と共生、共存の関係にある土壌の微生物の存在が挙げられる。

土壌から微生物DNAを検出または分離する技術は、これまでにいくつも報告されている。土壌から核酸を抽出するための既知の方法は、界面活性剤、リン酸、キレート剤などを含む抽出液で微生物菌体を破壊する。この抽出液は、土壌から腐植物質(例えば、腐植酸など)も同時に抽出する。この腐植物質が少しでも混入すると、引き続く分子生物学的な解析に弊害が生じる(例えば、Taq、制限酵素などの酵素活性を阻害する)。よって、酵素を用いる解析(例えば、RT-PCRなど)の前に、十分な精製作業を行う必要がある。しかし、このような精製操作は非常に煩雑であり、時間もコストもかかる。

本発明者らは、高塩濃度下にて抽出した核酸抽出液に、高分子ポリマーであるポリエチレングリコール(PEG)を添加するとともにその溶液のpHを上昇させることによって、DNAだけを沈殿させる土壌DNA回収法を開発した(特許文献1参照)。
【特許文献1】
WO2005/073377(国際公開日:2005(平成17)年8月11日)

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、土壌中の微生物に関する情報を簡便に得る技術に関するものであり、より詳細には、土壌から抽出したRNAを高度に精製する技術に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)をRNA抽出液へ添加してRNA溶液を調製した後に除タンパク操作を行う第1工程、およびポリエチレングリコール(PEG)存在下にて第1工程の除タンパク操作を行って得られたRNA溶液からRNAを回収する第2工程を包含するRNA精製法であって、第1工程がpH5.0~6.5の範囲内で行われ、かつ、第2工程がpH7.0以上にて行われることを特徴とするRNA精製法。

【請求項2】
 
前記CTABの濃度が2%(w/v)以上であることを特徴とする請求項1に記載のRNA精製法。

【請求項3】
 
前記PEGの濃度が5~15%(w/v)の範囲内であることを特徴とする請求項1または2のいずれか1項に記載のRNA精製法。

【請求項4】
 
第1工程が0.5~1.25Mの範囲内の塩存在下にて行われることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項に記載のRNA精製法。

【請求項5】
 
前記RNA抽出液が、SDS抽出またはグアニジンチオシアネート抽出によって得られたものであることを特徴とする請求項1~4のいずれか1項に記載のRNA精製法。

【請求項6】
 
回収したRNAを限外濾過に供する工程をさらに包含することを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載のRNA精製法。

【請求項7】
 
前記RNA抽出液が、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも1つに由来することを特徴とする請求項1~6のいずれか1項に記載のRNA精製法。

【請求項8】
 
CTAB、PEG、CTAB使用時に弱酸性環境を提供し得る緩衝液または緩衝化能を有する塩、および、PEG使用時にアルカリ性環境を提供し得る緩衝液または緩衝化能を有する塩を備えているRNA精製キットであって、弱酸性環境がpH5.0~6.5の範囲内であり、かつ、アルカリ性環境がpH7.0以上であることを特徴とするRNA精製キット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Plants Function and Their Control AREA
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