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COMPOSITION AND KIT FOR EXTRACTING NUCLEIC ACID, AND USE OF THEM achieved

Patent code P110004042
File No. A181P212
Posted date Jul 5, 2011
Application number P2007-255947
Publication number P2009-082068A
Patent number P5105237
Date of filing Sep 28, 2007
Date of publication of application Apr 23, 2009
Date of registration Oct 12, 2012
Inventor
  • (In Japanese)頼 泰樹
  • (In Japanese)大塚 重人
  • (In Japanese)中西 友子
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
  • (In Japanese)国立大学法人東京大学
Title COMPOSITION AND KIT FOR EXTRACTING NUCLEIC ACID, AND USE OF THEM achieved
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To achieve a technique for easily extracting RNA from soil in high yield.
SOLUTION: A composition and a kit for preparing a nucleic acid extract liquid are provided. The composition and the kit each contains allophane-masking agent(s), wherein the allophane-masking agent consists of at least one compound selected from the group consisting of fluoride compounds and silicic acid compounds. The composition and the kit may also contain EDTA, phosphoric acid and/or SDS(sodium dodecyl sulfate), respectively.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

生育している植物内での物質の分布および動態を知るために、植物内における物質動態をイメージングする技術が開発されている。

植物におけるイメージングを行う際の環境がその植物にとっての本来の生育環境に近似していることは、植物内における本来の物質動態を知るために重要であると考えられる。土壌のpH、無機塩類濃度といった土壌の理化学性および土壌中に存在する微生物が植物の生育に大きな影響を与えることは、古くから知られている。また、空気中に含まれている物質(特に微生物)も植物の生育に影響を与え得る。植物にとっての本来の生育環境を知るためには、植物が生育する土壌や、植物が置かれた雰囲気についての情報を解析する、優れた技術が不可欠であると考えられる。

微生物は、土壌中に非常に多く存在している(土壌1gあたりに108~109個)。その種類は極めて多様であり、天然に存在する微生物のうち、かなりの種類が土壌に分布しているといわれている。しかし、土壌中に存在する微生物は、培養が非常に困難であり、培養可能な土壌微生物は全体の10%に満たない。このように、土壌微生物はそのほとんどが未知の存在である。

近年、土壌から核酸を直接抽出して分子生物学的手法での解析を行うことにより、土壌微生物についての情報を得ることが可能になってきた。すなわち、土壌中の微生物に関する情報は、微生物由来の核酸(DNAまたはRNA)を土壌から検出することによって得られている。

土壌から微生物DNAを検出または分離する技術は、これまでにいくつも報告されている。土壌からのDNAの抽出技術は、培養困難な土壌微生物の遺伝子の取得を容易にし、未解明であった土壌微生物の群集解析、および酵素合成などに有用なコンビナトリアルケミストリーへ新たな土壌微生物遺伝子資源の供給を可能とし、学術的にも産業面にも大きく寄与した。

しかし、日本特有の土壌である火山灰土壌は、非晶質アルミニウム(アロフェン)を含有しているので、これらの物質が核酸抽出工程において溶液中の核酸を強力に吸着してしまい、その結果として、火山灰土壌からの核酸抽出が困難であった。

本発明者らは、EDTAおよびリン酸溶液を高濃度で使用することによってアロフェンの吸着能力を不活性化し、簡便にDNAを抽出する技術を開発している(特許文献1参照)。
【特許文献1】
WO2005/073377(国際公開日:2005(平成17)年8月11日)

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、土壌中の微生物に関する情報を簡便に得る技術に関するものであり、より詳細には、土壌から核酸を高収量で簡便に抽出する技術に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
pHが7~9の核酸抽出液を調製するための組成物であって、
5~50g/Lの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにNa2SiF6を含み、かつ、リン酸を含んでいることを特徴とする組成物。

【請求項2】
 
EDTAをさらに含んでいることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

【請求項3】
 
50~100mMの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにEDTAを含んでいることを特徴とする請求項2に記載の組成物。

【請求項4】
 
100~300mMの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにリン酸を含んでいることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

【請求項5】
 
界面活性剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

【請求項6】
 
前記界面活性剤がSDS、CTAB、Triton X-100およびN-ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群より選択されることを特徴とする請求項5に記載の組成物。

【請求項7】
 
5%以下の濃度で核酸抽出液中に供給されるように界面活性剤を含んでいることを特徴とする請求項5に記載の組成物。

【請求項8】
 
土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも1つに由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

【請求項9】
 
調製される核酸抽出液中において5~50g/Lの範囲内の濃度となるようにNa2SiF6を備え、かつ、リン酸を備えていることを特徴とするpHが7~9の核酸抽出液を調製するためのキット。

【請求項10】
 
EDTAをさらに備えていることを特徴とする請求項9に記載のキット。

【請求項11】
 
界面活性剤をさらに備えていることを特徴とする請求項9に記載のキット。

【請求項12】
 
5~50g/Lの範囲内の濃度でNa2SiF6を含み、かつ、リン酸を含むpHが7~9の抽出液中でサンプルから核酸を抽出する工程を包含することを特徴とする核酸抽出方法。

【請求項13】
 
5~50g/Lの範囲内の濃度でNa2SiF6を含む溶液を調製する工程、及び、該溶液にリン酸を含ませる工程を包含することを特徴とするpHが7~9の核酸抽出液の製造方法。

【請求項14】
 
前記溶液にEDTAを含ませる工程をさらに包含することを特徴とする請求項13に記載の製造方法。

【請求項15】
 
前記溶液に界面活性剤を含ませる工程をさらに包含することを特徴とする請求項13に記載の製造方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Plants Function and Their Control AREA
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