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MOLECULE DESIGN OF FUNCTIONAL RNA-PROTEIN COMPLEX

Patent code P110004246
File No. I029P007
Posted date Jul 8, 2011
Application number P2008-297752
Publication number P2009-142273A
Patent number P5308787
Date of filing Nov 21, 2008
Date of publication of application Jul 2, 2009
Date of registration Jul 5, 2013
Priority data
  • P2007-303660 (Nov 22, 2007) JP
Inventor
  • (In Japanese)井上 丹
  • (In Japanese)齊藤 博英
  • (In Japanese)倉光 祥平
  • (In Japanese)菊田 雅之
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title MOLECULE DESIGN OF FUNCTIONAL RNA-PROTEIN COMPLEX
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method to immobilize arbitrary proteins on RNA bases without damaging functional structures of bases such as proteins and RNA.
SOLUTION: An RNA-protein complex 1 comprises a base RNA2 having base sequences (boxB sequence, RRE sequence) 23, 24 derived from an RNA-protein complex 1 interaction motif; and fusion proteins 3, 4 containing amino acid sequences 31, 41 derived from RNA-protein complex interaction motif binding to protein (N peptides, Rev proteins) 30, 40 and the base sequences nonconvalently and specifically.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

ポストゲノム時代となった現在、多くのゲノム情報が蓄積されており、我々はそれらを利用できる状況にある。また、DNAや蛋白質を網羅的に解析するDNAアレイやプロテインアレイなどが普及し、医療などへの応用が望まれている。

RNA構造生物学の発展により、RNAの複雑な立体構造には階層性があり、それぞれが特定の機能を有するモジュールに分割できる事が示唆されてきた。その知見に基づき、RNAのモジュールを人工的に組み合わせ新たな機能性分子を構築する「モジュラーエンジニアリング」と、「in vitro selection法」を併用し、高いライゲーション活性を有するリボザイム(DSL)が創製された(非特許文献1を参照)。さらに近年、生体内のリボソームに代表されるRNA-蛋白質複合体(RNP)の高度な機能は、その構造に基づいている事が明らかになってきた。

いっぽう、蛋白質が機能を発揮する場合、他の蛋白質と結合して複合体を形成していることが多い。特に、その機能を複数同時に調節しようとする時には、蛋白質間の相対位置すなわち距離や配向は厳密に制御されている。その顕著な例が、細胞内のシグナル伝達系で見られる。分裂促進因子によって活性化されるタンパクキナーゼはMAPK(mitogen-activatedprotein kinase)と呼ばれている。MAPKの完全な活性化にはトレトニンとチロシンのリン酸化が必要であるが、このリン酸化を触媒するキナーゼはMAPKKと呼ばれており、さらにこのキナーゼもMAPKKKと呼ばれる酵素によってリン酸化され活性化される。活性化したMAPKは他のタンパクキナーゼや遺伝子調節蛋白質などをリン酸化し、下流にシグナルを伝える。この三つのキナーゼは足場蛋白質に結合している。足場蛋白質が無い状態では、キナーゼは自由に拡散し、ランダムあるいは非特異的な活性化で、シグナル伝達効率が低下する。足場蛋白質存在化では、基質の活性化が容易になり、特異的なシグナルカスケードを引き起こす。また、足場蛋白質の構造がアロステリックに変化し、さらにシグナル伝達が活性化されたり、足場蛋白質が細胞膜のアダプター蛋白質と結合し、部位特異的に機能したりもしている。この種の相互作用を解析するには、蛋白質間の距離や配向を調節し、制御する必要がある。

蛋白質を基盤上に並べる技術は、蛋白質を網羅的に解析するプロテインアレイの普及とともに必要不可欠なものとなってきた。現在では、蛋白質の末端にタグをつけプレート上の分子と結合させる方法、ガラスや特殊な膜を用いて固定する方法が一般的である。しかし、蛋白質の機能を損なわず基盤上に固定することは非常に困難である。また、思い通りの場所に並べることができたとしても、ほとんどの場合が二次元的であり、蛋白質間の相対位置を調節したような三次元的なものではない。

一方近年、生体内で機能する様々なノンコーディングRNAが発見され、その役割に注目が集まっている。しかしながらこれらRNAは生体内で多くの場合、蛋白質と複合体(RNP)を形成している。このことから、人工RNPは、細胞機能を制御できる新しいナノブロックとして期待されている。天然に存在するRNPは、比較的短い配列から構成されるRNA-蛋白質相互作用モチーフ(RNP motif)を利用して、多くの複合体を形成していることがわかる。例えばHIV Rev蛋白質は、Revを認識するRNAモチーフと、高い親和性で相互作用している。これらRNP相互作用モチーフを効果的に抽出し、リボザイム上に配置することで、RNA結合蛋白質存在下でのみ触媒活性をもつ、人工RNP酵素の作成に成功した研究も存在する(非特許文献2を参照)。したがってRNPは、シンセティックバイオロジー(生体分子を人工的に創り出す作業を通して生体分子や生命システムを再構築し、新しいテクノロジーを誘発する分野)研究の素材としての利用が期待されている(非特許文献3を参照)。
【非特許文献1】
Ikawa et al.Proc Natl Acad Sci U S A.;101(38):13750-5, 2004
【非特許文献2】
Atsumi et al. EMBO Journal, 20, 5453, 2001
【非特許文献3】
Saito et al. Journal of Biotechnology,132,1,1-7 2007

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、RNA-蛋白質複合体、およびRNA上への蛋白質の固定化方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
RNA-蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を2以上有する基盤RNAと、
蛋白質と、前記塩基配列に非共有結合的にかつ特異的に結合するRNA-蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列とを含む2以上の融合蛋白質と
を含んでなるRNA-蛋白質複合体であって、
前記基盤RNAが、人工のRNA配列に、前記基盤RNAとは異なるRNA由来の配列であり、天然に存在するRNA-蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を導入してなるセルフフォールディングするRNAである、RNA-蛋白質複合体。

【請求項2】
 
前記蛋白質が蛍光蛋白質、発光蛋白質、アポトーシス誘導蛋白質、酵素、抗体から選択される機能性蛋白質である、請求項1に記載のRNA-蛋白質複合体。

【請求項3】
 
前記融合蛋白質が、前記蛋白質と、前記アミノ酸配列との間にさらにリンカーを含んでなる請求項1または2に記載のRNA-蛋白質複合体。

【請求項4】
 
前記天然のRNA-蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、バクテリオファージλ由来のboxB配列であり、前記天然のRNA-蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列が、バクテリオファージλ由来のNペプチド配列である請求項1~3のいずれかに記載のRNA-蛋白質複合体。

【請求項5】
 
前記天然のRNA-蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、HIV由来のRRE配列であり、前記天然のRNA-蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列が、HIVRev蛋白質由来の配列である請求項1~3のいずれかに記載のRNA-蛋白質複合体。

【請求項6】
 
前記セルフフォールディングするRNAが、typeB RNAを含む、請求項1に記載のRNA-蛋白質複合体。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2008297752thum.jpg
State of application right Registered
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