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(In Japanese)抗生物質によるタンパク質の転写・分解二重制御法

Patent code P110004403
File No. K022P53
Posted date Jul 13, 2011
Application number P2009-505252
Patent number P5126907
Date of filing Mar 14, 2008
Date of registration Nov 9, 2012
International application number JP2008055200
International publication number WO2008114856
Date of international filing Mar 14, 2008
Date of international publication Sep 25, 2008
Priority data
  • P2007-065415 (Mar 14, 2007) JP
Inventor
  • (In Japanese)三輪 佳宏
Applicant
  • Japan Science and Technology Agency
Title (In Japanese)抗生物質によるタンパク質の転写・分解二重制御法
Abstract (In Japanese)本発明は、(a)抗生物質に結合するリプレッサータンパク質の変異体と目的のタンパク質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および(b)(a)のポリヌクレオチドの転写を制御するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、を発現可能に含む発現ベクターであって、細胞内での(a)のポリヌクレオチドの転写および(a)のポリヌクレオチドの発現産物である前記融合タンパク質の分解が、細胞内での抗生物質の有無によって制御される、発現ベクターを提供する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

細胞タンパク質の機能解析等を目的として、外来刺激により制御可能な遺伝子発現系を開発する試みがなされている。

特表平11-506901は、1つ以上のtetオペレーターに結合した遺伝子の発現を調節することができる、転写アクチベーターおよび転写インヒビター融合タンパク質を開示する。特表平11-506901に開示される転写アクチベーターによれば、テトラサイクリンの存在時にtetオペレーターに結合してtetオペレーターに結合された遺伝子の転写を刺激するが、不在時には結合等しない(したがって、転写の刺激をしない)、という制御が可能であると報告されている。

STANKUNAS K et al.,“Conditional protein alleles usingknockinmice anda chemical inducer of dimerization”,Mol Cell.,2003,Vol.12,No.6,p.1615-24は、FRAP(FKBP12-ラパマイシン結合タンパク質)のFKBP-12ラパマイシン結合のための最小領域である89アミノ酸ドメインであるFRB*と、GSK-3β(内因性のグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β)との融合タンパク質GSK-3βFRB*を開示する。STANKUNAS K et alは、FRB*がGSK-3βの不安定化を引き起こすこと、すなわち、GSK-3βがFRB*と融合することによって不安定化し、分解することを記載する。さらに、STANKUNAS K et alは、GSK-3βFRB*が、ラパマイシン誘導体(C20-MaRap)の存在下で、FKBP12に結合し、この相互作用がGSK-3βFRB*を安定化することを記載する。STANKUNAS K et alのシステムは、専らラパマイシン誘導体を利用することによって、FKB*とFKBP12の2量体化を促進するものとして記載されている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、抗生物質による遺伝子の転写制御方法および/またはタンパク質の分解制御方法に関する。特に、本発明は、抗生物質による遺伝子の転写制御およびタンパク質の分解制御を含む二重制御方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
目的遺伝子を組換え配列の間および/または下流に発現可能に含む発現ベクターを導入した細胞においてテトラサイクリン系抗生物質の有無によって該細胞内での該目的遺伝子の発現を転写レベルおよびタンパク質レベルで制御するための遺伝子発現制御組成物であって、
(a)前記抗生物質に結合するリプレッサータンパク質の変異体と組換え酵素との融合タンパク質であって、前記組換え配列部位での組換えを仲介し、前記抗生物質の非存在下では前記細胞内で分解される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記変異体が、配列番号2の野生型テトラサイクリンリプレッサータンパク質のアミノ酸配列における95位のアスパラギン酸のアスパラギンによる置換、101位のロイシンのセリンによる置換、および102位のグリシンのアスパラギン酸による置換のうちの少なくとも2つの変異を有する、ポリヌクレオチド、および
(b)(a)のポリヌクレオチドの転写制御領域に結合し、該ポリヌクレオチドの転写を増強するタンパク質であって、前記抗生物質の非存在下では前記転写制御領域に結合しないタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を発現可能に含む発現ベクターを含む、組成物。

【請求項2】
 
前記組換え酵素が、
(a)Creリコンビナーゼ;
(b)FLPリコンビナーゼ;
(c)ファージphi(ファイ)13インテグラーゼ;
(d)ファージR4インテグラーゼ;
(e)ファージTP901-1インテグラーゼ;
(f)ファージλ(ラムダ)インテグラーゼ;
(g)ファージHK022インテグラーゼ;
(h)β(ベータ)リコンビナーゼ;
(i)Rリコンビナーゼ;
(j)γδ(ガンマデルタ)レソルバーゼ;
(k)Dreリコンビナーゼ;
(l)ファイRv1インテグラーゼ;
(m)Int;
(n)IHF;
(o)Xis;
(p)Fis;
(q)Hin;
(r)Gin;
(s)Cin;
(t)Th3レソルバーゼ;
(u)TndX;
(v)XerC;および
(w)XerD
からなる群から選択される1以上のタンパク質である、請求項1に記載の組成物。

【請求項3】
 
前記組換え配列が、
(a)loxP;
(b)frt;
(c)attB/attP;
(d)six;
(e)RS;
(f)res;
(g)rox;
(h)psi;
(i)dif;
(j)cer;および
(k)組換えを起こす能力を保持した(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、または(j)の組換え配列の変異体、改変体、または誘導体からなる群より選択される1以上の組換え配列を含む、請求項1または2に記載の組成物。

【請求項4】
 
前記組換え酵素がCreリコンビナーゼであり、前記組換え配列がloxP配列である、請求項1~3のいずれかに記載の組成物。

【請求項5】
 
前記目的遺伝子が、転写因子である、請求項1~4のいずれかに記載の組成物。

【請求項6】
 
前記転写因子が、Oct3/4、Klf4、Sox2、またはc-Myc遺伝子のいずれかである、請求項5に記載の組成物。

【請求項7】
 
前記(b)のポリヌクレオチドが、前記(a)のポリヌクレオチドの転写制御領域に結合して該ポリヌクレオチドの転写を増強するタンパク質をコードし、該タンパク質は、前記抗生物質と結合した場合にのみ該転写制御領域に結合することができる、請求項1~6のいずれかに記載の組成物。

【請求項8】
 
前記テトラサイクリン系抗生物質が、テトラサイクリン、またはその誘導体であるドキシサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、もしくは無水テトラサイクリンである、請求項1~7のいずれかに記載の組成物。

【請求項9】
 
前記リプレッサータンパク質の変異体が、テトラサイクリンリプレッサータンパク質の変異体である、請求項1~8のいずれかに記載の組成物。

【請求項10】
 
前記テトラサイクリンリプレッサータンパク質の変異体が、野生型テトラサイクリンリプレッサータンパク質のアミノ酸配列において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有する、請求項9に記載の組成物。

【請求項11】
 
前記アミノ酸残基の置換が、野生型テトラサイクリンリプレッサータンパク質のアミノ酸配列の95位のアスパラギン酸、101位のロイシン、および102位のグリシンのいずれか少なくとも2つの部位において存在する、請求項10に記載の組成物。

【請求項12】
 
インビトロまたはトランスジェニック非ヒト動物においてテトラサイクリン系抗生物質の有無によって細胞内での目的遺伝子の発現を制御するための遺伝子発現制御方法であって、
(a)(a1)前記抗生物質に結合するリプレッサータンパク質の変異体と組換え酵素との融合タンパク質であって、前記組換え配列部位での組換えを仲介し、前記抗生物質の非存在下では前記細胞内で分解される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記変異体が、配列番号2の野生型テトラサイクリンリプレッサータンパク質のアミノ酸配列における95位のアスパラギン酸のアスパラギンによる置換、101位のロイシンのセリンによる置換、および102位のグリシンのアスパラギン酸による置換のうちの少なくとも2つの変異を有する、ポリヌクレオチド、および
(a2)(a1)のポリヌクレオチドの転写制御領域に結合し、該ポリヌクレオチドの転写を増強するタンパク質であって、前記抗生物質の非存在下では前記転写制御領域に結合しないタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を発現可能に含む発現ベクター、ならびに
(b)目的遺伝子を組換え配列の間および/または下流に発現可能に含む発現ベクター
を、前記細胞内で前記抗生物質の存在下または非存在下で発現させる工程を含む、方法。

【請求項13】
 
前記組換え酵素が、
(a)Creリコンビナーゼ;
(b)FLPリコンビナーゼ;
(c)ファージphi(ファイ)13インテグラーゼ;
(d)ファージR4インテグラーゼ;
(e)ファージTP901-1インテグラーゼ;
(f)ファージλ(ラムダ)インテグラーゼ;
(g)ファージHK022インテグラーゼ;
(h)β(ベータ)リコンビナーゼ;
(i)Rリコンビナーゼ;
(j)γδ(ガンマデルタ)レソルバーゼ;
(k)Dreリコンビナーゼ;
(l)ファイRv1インテグラーゼ
(m)Int;
(n)IHF;
(o)Xis;
(p)Fis;
(q)Hin;
(r)Gin;
(s)Cin;
(t)Th3レソルバーゼ;
(u)TndX;
(v)XerC;および
(w)XerD
からなる群から選択される1以上のタンパク質である、請求項12に記載の方法。

【請求項14】
 
前記組換え配列が、
(a)loxP;
(b)frt;
(c)attB/attP;
(d)six;
(e)RS;
(f)res;
(g)rox;
(h)psi;
(i)dif;
(j)cer;および
(k)組換えを起こす能力を保持した(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、または(j)の組換え配列の変異体、改変体、または誘導体からなる群から選択される1以上の組換え配列を含む、請求項12または13に記載の方法。

【請求項15】
 
前記組換え酵素がCreリコンビナーゼであり、前記組換え配列がloxP配列である、請求項1214のいずれかに記載の方法。

【請求項16】
 
前記目的遺伝子が、c-Myc遺伝子である、請求項1215のいずれかに記載の方法。

【請求項17】
 
前記発現ベクターが、(a)の融合タンパク質のアミノ酸配列のC末端側に核外移行配列を付加してなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド含む、請求項1~9のいずれかに記載の組成物。

【請求項18】
 
前記(a)の発現ベクターが、(a1)の融合タンパク質のアミノ酸配列のC末端側に核外移行配列を付加してなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド含む、請求項1216のいずれかに記載の方法。

【請求項19】
 
目的遺伝子を組換え配列の間および/または下流に発現可能に含む発現ベクターを導入した細胞においてテトラサイクリン系抗生物質の有無によって該細胞内での該目的遺伝子の発現を転写レベルおよびタンパク質レベルで制御するための遺伝子発現制御組成物であって、
(a)前記抗生物質に結合するリプレッサータンパク質の変異体と組換え酵素との融合タンパク質であって、前記組換え配列部位での組換えを仲介し、前記抗生物質の非存在下では前記細胞内で分解される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能に含む発現ベクターであって、前記変異体が、配列番号2の野生型テトラサイクリンリプレッサータンパク質のアミノ酸配列における95位のアスパラギン酸のアスパラギンによる置換、101位のロイシンのセリンによる置換、および102位のグリシンのアスパラギン酸による置換のうちの少なくとも2つの変異を有する、発現ベクター、および
(b)(a)のポリヌクレオチドの転写制御領域に結合し、該ポリヌクレオチドの転写を増強するタンパク質であって、前記抗生物質の非存在下では前記転写制御領域に結合しないタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能に含む発現ベクター
を含む、組成物。

【請求項20】
 
インビトロまたはトランスジェニック非ヒト動物においてテトラサイクリン系抗生物質の有無によって細胞内での目的遺伝子の発現を制御するための遺伝子発現制御方法であって、
(a)前記抗生物質に結合するリプレッサータンパク質の変異体と組換え酵素との融合タンパク質であって、前記組換え配列部位での組換えを仲介し、前記抗生物質の非存在下では前記細胞内で分解される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能に含む発現ベクターであって、前記変異体が、配列番号2の野生型テトラサイクリンリプレッサータンパク質のアミノ酸配列における95位のアスパラギン酸のアスパラギンによる置換、101位のロイシンのセリンによる置換、および102位のグリシンのアスパラギン酸による置換のうちの少なくとも2つの変異を有する、発現ベクター
(b)(a)のポリヌクレオチドの転写制御領域に結合し、該ポリヌクレオチドの転写を増強するタンパク質であって、前記抗生物質の非存在下では前記転写制御領域に結合しないタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能に含む発現ベクター、ならびに
(c)目的遺伝子を組換え配列の間および/または下流に発現可能に含む発現ベクター
を、前記細胞内でテトラサイクリン系抗生物質の存在下または非存在下で発現させる工程を含む、方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2009505252thum.jpg
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) PRESTO Structure Function and Measurement Analysis AREA
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