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METHOD FOR PRODUCING AIMED PROTEIN

Patent code P110004797
Posted date Aug 18, 2011
Application number P2007-152567
Publication number P2008-301768A
Patent number P5152962
Date of filing Jun 8, 2007
Date of publication of application Dec 18, 2008
Date of registration Dec 14, 2012
Inventor
  • (In Japanese)朴 龍洙
  • (In Japanese)金政 真
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人静岡大学
Title METHOD FOR PRODUCING AIMED PROTEIN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing aimed protein of high expression efficiency.
SOLUTION: The method for producing the aimed protein comprises the step of introducing, into an insect-derived cell, an aimed protein-expressing bacmid comprising miniF replicon, baculovirus DNA, a polynucleotide encoding the aimed protein and a promoter for expressing the aimed protein, and a molecular chaperon-expressing bacmid comprising miniF replicon, baculovirus DNA, a polynucleotide encoding a molecular chaperon and a molecular chaperon-expressing promoter, earlier than transcription activation and lower in the transcription level than that of the promoter.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

バキュロウイルス遺伝子発現系は、真核生物である昆虫由来の細胞中で組換えタンパク質を生産するため、糖鎖付加、リン酸化などの翻訳後修飾が行われるため、活性を有する組換えタンパク質の大量生産に適している。
さらに効率よく組換え遺伝子の発現を行うために、カイコ発現系に利用されるカイコガ核多角体病ウイルス(BmNPV)をBAC(Bacterial Artificial Choromosome)クローン化できるBmNPVシャトルベクター(バクミド)が開発され、大腸菌体内でのクローニングや組換えウイルスの構築を迅速に行うことができるようになった(例えば、特許文献1参照)。

真核生物の細胞におけるタンパク質発現では、細胞内器官である小胞体においてタンパク質の翻訳後修飾が行われる。翻訳後修飾は各種の分子シャペロンによってなされており、例えば、糖鎖付加、ジスルフィド結合の形成、フォールディング等が挙げられる。
また、熱ショックに対する応答として、タンパク質の構造を正常に維持する作用を有する1種の分子シャペロンであるヒートショックプロテインが細胞質に発現することが知られている。

また、昆虫細胞を用いた目的タンパク質発現系において、目的タンパク質の回収率の向上を目指し、目的タンパク質を発現するプラスミドと分子シャペロンを発現するプラスミドとを用いて形質転換した細胞株が知られている。前記形質転換細胞株においては、目的タンパク質と分子シャペロンとが同時に安定的に発現していることで目的タンパク質の回収率が向上するとされている(例えば、非特許文献1参照)。

【特許文献1】
特開2004-173507号公報
【非特許文献1】
Biotechnol. Bioeng., 2004, Vol.89, p424-433.

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、目的タンパク質の製造方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
miniFレプリコンと、バキュロウイルスDNAと、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、目的タンパク質発現用プロモーターとを含む目的タンパク質発現バクミドと、
miniFレプリコンと、バキュロウイルスDNAと、分子シャペロンをコードするポリヌクレオチドと、前記目的タンパク質発現用プロモーターと比べて転写活性化がより早期であり且つ転写量がより少ない分子シャペロン発現用プロモーターとを含む分子シャペロン発現バクミドと、
を昆虫由来の細胞に導入する工程を含み、
前記分子シャペロン発現用プロモーターは、OpIE2プロモーターであり、
前記分子シャペロンがERp57、BiP、又はHSP70である、
目的タンパク質の製造方法。

【請求項2】
 
前記目的タンパク質発現用プロモーターは、ポリヘドリンプロモーターである請求項1に記載の目的タンパク質の製造方法。

【請求項3】
 
前記分子シャペロンが、ERp57又はBiPである請求項1又は請求項2に記載の目的タンパク質の製造方法

【請求項4】
 
前記バキュロウイルスDNAは、BmNPV DNA又はAcMNPV DNAである請求項1~請求項3のいずれか1項に記載の目的タンパク質の製造方法。

【請求項5】
 
前記昆虫細胞がカイコガの細胞である請求項1~請求項3のいずれか1項に記載の目的タンパク質の製造方法。

【請求項6】
 
前記目的タンパク質発現バクミド及び前記分子シャペロン発現バクミドの少なくとも一方は、ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも1種を欠損しているバクミド変異体である請求項1~請求項5のいずれか1項に記載の目的タンパク質の製造方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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