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(In Japanese)インスリン産生細胞特異的プロモーターおよびその用途

Patent code P110005324
Posted date Aug 18, 2011
Application number P2006-550751
Patent number P4825978
Date of filing Dec 26, 2005
Date of registration Sep 22, 2011
International application number JP2005023758
International publication number WO2006070729
Date of international filing Dec 26, 2005
Date of international publication Jul 6, 2006
Priority data
  • P2004-376737 (Dec 27, 2004) JP
  • P2005-017478 (Jan 25, 2005) JP
Inventor
  • (In Japanese)田中 紀章
  • (In Japanese)小林 直哉
  • (In Japanese)深沢 拓也
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人岡山大学
Title (In Japanese)インスリン産生細胞特異的プロモーターおよびその用途
Abstract (In Japanese)インスリンを産生するヒトβ細胞の選択を効率よく行なうために、特異性が高く、転写活性の強い新規なプロモーターを提供すること。a)配列番号1で表わされる塩基配列の5′側に配列番号2で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、またはb)前記a)のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、インスリン産生細胞においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドからなるプロモーター。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

本邦では、糖尿病患者は増加の一途を辿っており、糖尿病が強く疑われる人が690万人、その可能性を否定できない人を含めると1,370万人である(1997年糖尿病実態調査)。現在わが国で、インスリン療法施行者は約41万人である。その内の腎不全などの重症合併症を有する5%の2万人がバイオ人工膵臓の治療対象となる。また、国民医療費の概況(厚生省実施1998年)によると、糖尿病患者の直接医療費が日本で1兆325億円である。また、世界の糖尿病人口は現在1億5千万人で、2010年にはその数は1.4倍になると予測されており市場は今後ますます増加する。

インスリン投与療法では、厳格な監視下でも合併症(失明、四肢切断、腎不全など)の発症防止は極めて困難である。そこで、生きた細胞を利用した糖尿病治療は、廃絶した血糖降下の生理的システムを再び獲得させることができ、患者のQOLの著名な改善(飲食の制限、頻回な血糖測定、インスリン投与の副作用である低血糖の恐怖から解放)、長期合併症の予防ができる。本研究の成功は、糖尿病という慢性疾患の完全治癒を可能とし、さらにはかつて天然痘、ポリオなどの感染症に対して人類がなしえた撲滅宣言を糖尿病に対しても果たし得る大きな原動力となる。臓器移植に伴うドナー不足の問題がなく、万人がその恩恵を受けることができる。2000年にアルバータ大学から良好な膵島移植の成績が報告され、糖尿病治療に関して膵島移植は理想的な治療法であるとの認識が広まった。しかし提供元となる膵臓の絶対的不足が大きな課題となっており、移植用細胞源の候補として、ヒトES細胞、肝幹細胞、間葉系幹細胞などのヒト由来の未分化細胞からヒトβ細胞を分化誘導する研究が行われている(たとえば、モリトウら、DIABETES, VOL. 2003 May 52(5):1163-1168、ルメルスキー(Lumelsky)ら、Science, 2001 May 18;292(5520):1389-1394、ザルツマン(Zalzman)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003 Jun. 10;100(12):7253-7258およびマシマら、J. Clin. Invest. 1996 Apr. 1;97(7):1647-1654参照)。これらの方法によってβ細胞が誘導される確率は、あまり高いものではなく、むしろその母集団となる未分化細胞から誘導された少数のβ細胞を選定する操作が重要となる。

一般的に選別前の複数のバックグラウンドを持つ細胞集団(バルクの状態)から目的の集団を選別する場合、1)リングクローニング法、2)限界希釈法、3)単一細胞選別法、4)抗体を用いた細胞選別法、および5)プロモーターを用いた選別法などが用いられている。しかしながら、1)~3)の方法では、選別の過程において細胞を増殖させることを前提に選別を行なうものであり、ヒトES細胞、間葉系幹細胞などのヒト由来の未分化細胞は増殖能を持っているものの、分化誘導を行うと増殖能を失うためこのような方法を適用することができない。また、4)の方法では、選別対象とする細胞集団がその表面に特異的膜タンパク質(レセプター類)を発現していることを前提としている。したがって、そのような特異的レセプターを細胞表面に提示していないインスリン産生細胞には好適に使用することができない。

一方、前記5)の方法は、目的タンパク質を発現する細胞を含む細胞集団に対して、目的タンパク質発現に関与するプロモーター領域とその下流にレポーター遺伝子とを含有するプラスミドをバルク細胞集団にトランスフェクションし、レポーター遺伝子発現陽性細胞をセルソーターや抗生剤耐性遺伝子などを用いて選別する方法である(たとえば、ソリア(Soria)ら、Diabetologia (2001) 44: 407-415参照)。この方法は、インスリン産生細胞の選別に適用可能であるが、天然のプロモーター配列をそのまま使用した場合、インスリン産生細胞非特異的転写活性部位により特異度が落ち、より厳密な細胞の選定を行なうことはできない。そのため、より目的タンパク質特異的な転写活性を有するプロモーター領域を同定、使用する必要があり初期実験に時間を要する。また、特異度があってもプロモーター活性が微弱であった場合、レポーター遺伝子等、下流に挿入された配列を充分に発現できないという問題点がある。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、新規なインスリン産生細胞特異的プロモーターおよびその用途に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
列番号1で表わされる塩基配列の5′側に配列番号2で表わされる塩基配列を1~4個含有するポリヌクレオチドからなるプロモーター。

【請求項2】
 
請求項1記載のプロモーターを含むベクター。

【請求項3】
 
請求項1記載のプロモーターの3′側にレポーター遺伝子および/または抗生剤耐性遺伝子が連結されている請求項2記載のベクター。

【請求項4】
 
(a)請求項1記載のプロモーターの3′側にレポーター遺伝子および抗生剤耐性遺伝子が連結されているベクターを、未分化細胞に導入する工程、
(b)(a)で得られたベクター含有未分化細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する工程、
(c)レポーター遺伝子の発現により、インスリン産生細胞への分化を確認する工程、および
(d)抗生剤耐性遺伝子に対応する抗生剤を添加することにより、インスリン産生細胞を選択する工程
を含むインスリン産生細胞の選択方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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