胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法および該方法により誘導される肝細胞

• 特願2005-028200 (2005.2.3) JP

• 田中 紀章
• 小林 直哉

• 国立大学法人岡山大学

肝臓は、人体の中で最大の実質臓器であり、その機能は糖質、蛋白質、脂肪の代謝を始めビリルビン代謝、薬物代謝、血液凝固因子の生成など多岐にわたり、未知な機能を含めると肝臓の機能は数百にものぼり生体において非常に重要な役割を果たしている。よって、たとえそれが一時的なものであれ、重篤な肝臓疾患は患者の生命にとって極めて危険である。

一方で、肝臓は旺盛な再生能を有し、劇症肝不全で肝傷害を受けたとしても、一週間ほど肝機能を代替することができれば患者は回復する。こうした重篤な肝疾患に対して、肝臓移植が最も効果的であることは事実であるが、深刻なドナー不足を鑑みると万人がその恩恵を受けることはできない。目下、我が国では、一時的に肝機能を代替する手段として、持続濾過透析と血漿交換を組み合わせることで、ある程度の救命率は得られているものの、充分とはいい難く、更なる有効な治療法の確立が必要であり、治療用人工肝臓の開発に対するニーズが高まっている。そこで、期待されているのが、生きた細胞の代謝能力やタンパク質合成能を活用するために細胞を充填したバイオ人工肝臓である。

バイオ人工肝臓は、肝細胞を担体に組み込んで固定しリアクター化した生体内の肝臓を模倣した人工肝臓装置と言える。患者の血液を当該装置内に導き、肝細胞の代謝能を利用して血液中のトキシンの除去と肝臓細胞に由来する凝固因子などの生理活性物質の供給とを行なうことができる。細胞源としては、健常ヒト肝細胞が理想であるがドナー肝の不足からその入手はきわめて困難である。欧米では、移植不適合肝臓は肝細胞分離へと活用され、肝細胞移植やバイオ人工肝臓へと臨床応用されているが、本邦では移植不適合肝臓は焼却と規定されており、そのバイオ人工肝臓への活用は不可能である。

こうした問題の対策として、ヒト末梢血幹細胞、骨髄幹細胞そして肝前駆細胞などからヒト肝細胞への誘導が研究されているが、これらの細胞は増殖能に乏しく、バイオ人工肝臓への応用に値する細胞数（十億個以上）を確保するのは現実的ではない。一方で、欧米、中国では、ブタ肝細胞を使用したバイオ人工肝臓治験がヒトで行なわれているが、ブタ内因性レトロウイルス感染、Ｅ型肝炎などの人畜共通感染症が問題視されており今後の進展が厳しい現状にある。

また、最終分化したヒト細胞を標的に遺伝子組み換えによる不死化細胞株の樹立が検討されているが、これらの遺伝子組み換えを用いた方法では、外来遺伝子を導入するため、ヒトへの応用に際しては、遺伝子導入細胞の染色体の変化およびそれに伴う細胞の腫瘍化などといった安全面でのハードルが高い（Craig D. Woodworth et al., Molecular and Cellular Biology Oct. 4492-4501, 1988）。さらに、レトロウイルスベクターの使用に関しては、フランスのＸ染色体連鎖先天性重複性重症免疫不全症（X-Linked SCID）患児に対する、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子治療でのγδ－Ｔ細胞性白血病が発症するという事故が２００２年９月に報告されて以来、慎重な姿勢が取られている（S. Hacein-Bey-Abina et al., Science, Vol. 302(17), 415-419, 2003）。

以上より、臨床応用の実現可能なバイオ人工肝臓を開発するに当たっては、より自然な形に近い細胞源の検討が必要とされている。

一方、ＥＳ細胞には、１）生体を構成するあらゆる種類の細胞に分化でき、２）半永久的に増殖する能力があることから低コストで大量培養が可能であり、３）遺伝子の組換えを行なわず細胞増殖因子を用いた誘導法が適用可能であるため、遺伝子改変細胞に比べより自然体に近い細胞を入手できるなどといった利点がある。

幹細胞から肝細胞を分化誘導する方法としては、肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor：ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、デキサメタゾン、オンコスタチンＭ（インターロイキン６のファミリーに属する）、ｎ－酪酸などが使用されているが、充分に機能的な肝細胞への誘導は可能ではない（Rambhatla L et al., Cell Transplant. Vol.12, 1-11, 2003、Schwartz RE et al. J. Clin. Invest. 109; 1291-1302, 2002 および特表２００３－５３０８７９号公報）。また、肝障害を惹起したマウスの肝臓にＥＳ細胞を移植することでＥＳ細胞の肝細胞への分化誘導を促した例も報告されているが（Yamamoto H et al. Hepatology 2003 37:983, 2003）、操作が繁雑であり、分化した肝細胞を障害マウスの肝臓から回収しなければならないなどの問題点がある。

本発明は、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞ともいう）の肝細胞への分化誘導方法および該方法により誘導される肝細胞、ならびにバイオ人工肝臓に関する。

• C12N   5/071     脊椎動物細胞または組織，例．ヒト細胞または組織
• C12N  15/09      組換えＤＮＡ技術

• 4B024AA11 分析、診断
• 4B024CA09 プローブ
• 4B024HA14 ハイブリダイゼイション条件
• 4B029AA02 液体培養・発酵
• 4B029BB11 動物細胞
• 4B029CC01 浮遊
• 4B029GA08 その他
• 4B029GB09 材質に特徴
• 4B063QA05 性質、機能の解析（ＦＷ）
• 4B063QA18 物質の同定、微生物の同定
• 4B063QQ20 その他（ＦＷ）
• 4B063QR72 高等動物（細胞、未分化細胞集団→ＱＲ７７）
• 4B063QR77 動物の細胞、未分化細胞集団
• 4B063QX01 視覚的、光学的なもの（←発色、吸光度）
• 4B064AG24 アルブミン
• 4B064CA10 動物細胞、組織（ＦＷ）
• 4B064DA01 医薬；予防、治療
• 4B065AA91 ネズミ由来（マウス、ラット）
• 4B065AA93 ヒト由来
• 4B065AC20 その他
• 4B065BB31 特定成分を除いた培地
• 4B065CA16 窒素原子（Ｎ）を含むもの
• 4B065CA24 ペプチド、蛋白質
• 4B065CA44 医薬（ヒト用）；医療
• 4B065CA46 診断、検査