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(In Japanese)タンパク質のN末を酵素的に修飾する方法 meetings

Patent code P110005411
File No. H17-.37
Posted date Aug 18, 2011
Application number P2007-546539
Patent number P5061351
Date of filing Nov 22, 2006
Date of registration Aug 17, 2012
International application number JP2006323879
International publication number WO2007061128
Date of international filing Nov 22, 2006
Date of international publication May 31, 2007
Priority data
  • P2005-337537 (Nov 22, 2005) JP
Inventor
  • (In Japanese)西川 一八
  • (In Japanese)横川 隆志
  • (In Japanese)大野 敏
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人岐阜大学
Title (In Japanese)タンパク質のN末を酵素的に修飾する方法 meetings
Abstract (In Japanese)本願発明は、N末端を修飾したタンパク質を大量に提供することを課題とする。
本願発明は、N末端にArg又はLysを有する蛋白質については、当該末端にLeu又はPheを付加する能力を備えたロイシン/フェニルアラニン-tRNAタンパク質転移酵素(LFPT)を用いて、修飾フェニルアラニンtRNAPheから修飾フェニルアラニンをN末端アルギニンに付加させることにより、N末に修飾されたフェニルアラニンを有するタンパク質を調製する方法を提供する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

タンパク質に修飾を施すことにより、そのタンパク質の機能を改変又は増強する試みは種々行われている。例えば、血中に投与するタンパク質をPEG化することにより、血中滞在時間を延長させることなどが既になされている。
このような、タンパク質の修飾のため、タンパク質を合成時に、タンパク質中のアミノ酸に部位特異的にラベル化する技術として、アンバーサプレッションを用いて、ペプチド鎖中の任意の位置にラベルを導入する技術、C末端ラベル(修飾)する技術として、ピューロマイシン誘導体を用いてペプチド鎖のC末端にラベルを導入する方法、N末端ラベル(修飾)法として、αアミノ基を修飾した開始メチオニンを用いてペプチド鎖のN末端にラベルを導入する方法などが知られている。
このうち、N末端ラベル化タンパク質合成としては、(1)開始tRNAにメチオニンをチャージした後で、αアミノ基を目的のラベル化剤で修飾し、(2)修飾メチオニル開始tRNAを精製し、(3)大腸菌S30抽出液でタンパク質を合成する際に上記修飾開始tRNAを添加して合成する方法が知られている。具体的には、既に以下の方法が報告されている(特許文献1-3、及び非特許文献1-6)。
【特許文献1】
米国特許第6210941号 Methods for the detection and isolation of proteins
【特許文献2】
米国特許第6303337号 N-terminal and C-terminal markers in nascent proteins
【特許文献3】
米国特許6306628号 Methods for the detectin,analysis and isolation of nascent proteins
【非特許文献1】
Gite S.,at al.(2000)Anal.Biochem.279,218-225 Ultrasensitive fluorescence-based detection of nascent proteins in gels
【非特許文献2】
Olejnik J.,et al.(2005)Methods,36,252-260N-terminal labeling of proteins using initiator tRNA
【非特許文献3】
Kudlicki W et al.(1994)J.Mol.Biol.,244,319-331 Chaperone-dependent folding and activation of ribosome-bound nascent rhodanese.Analysis by fluorescence.
【非特許文献4】
Tsalkova T.,et al.(1998)J.Mol.Biol.,278,713-723.Different conformations of nascent peptides on rinosomes.
【非特許文献5】
McIntosh B.,et al.,(2000)Biochimie,82,167-174 Initiation of protein synthesis with fluorphore-Met-tRNA(f)and the involvement of IF-2
【非特許文献6】
RamachandiranV.Et al.,(2000)J.Biol.Chem.,275,1781-1786 Fluorphores at the N-terminus of nascent chloramphenicol acethyltransferase peptides affect translation and movement through the ribosome.

Field of industrial application (In Japanese)

本願発明は、タンパク質の修飾又は修飾の技術分野に関する。更に本願発明は、タンパク質のN末の修飾又は標識する技術、並びに、タンパク質のN末に変異を与える技術に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
(1)(イ)配列番号3で表されるアミノ酸配列において、415位のトレオニンをアラニン又はグリシンに変異させた変異型のPheRSαサブユニット、並びに
(ロ)配列番号2で表されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のPheRSβサブユニットからなる変異PheRSであって、
tRNAPheをフェニルアラニンアナログ化できる変異PheRSにより修飾フェニルアラニンをtRNAPheに結合させることにより修飾フェニルアラニルtRNAPheを調製し、
(2)N末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質及び前記(1)で調製された修飾フェニルアラニルtRNAPheをロイシル/フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素の存在下で処理する、
N末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質の修飾方法。

【請求項2】
 
修飾フェニルアラニンが下記式(1)で表される請求項1記載の方法。
(式省略)
上記式1中、R2は、水素、水酸基又はメトキシ若しくはアセチル、R3は水素又は水酸基、そして、R4は、水素、ハロゲン、アジド基、ニトロ基、メトキシ若しくはアセチル又は水酸基である。

【請求項3】
 
修飾フェニルアラニンがpara-azido-phenylalanine又は蛍光標識されたフェニルアラニンである請求項2記載の方法。

【請求項4】
 
N末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質が任意の蛋白質をペプチダーゼにて処理して調製された請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
 
N末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質を、以下(1)-(4)の存在下で処理することによる、N末アルギニン又はリジンを有するタンパク質の修飾方法。
(1)修飾フェニルアラニン、
(2)tRNAPhe
(3)(イ)配列番号3で表されるアミノ酸配列において、415位のトレオニンをアラニン又はグリシンに変異させた変異型のPheRSαサブユニット、並びに
(ロ)配列番号2で表されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のPheRSβサブユニットからなる変異PheRSであって、
tRNAPheをフェニルアラニンアナログ化できる変異PheRS(変異型フェニルアラニルtRNA合成酵素)、及び
(4)ロイシル/フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素

【請求項6】
 
修飾フェニルアラニンが下記式(1)で表される請求項5記載の方法。
(式省略)
上記式1中、R2は、水素、水酸基又はメトキシ若しくはアセチル、R3は水素又は水酸基、そして、R4は、水素、ハロゲン、アジド基、ニトロ基、メトキシ若しくはアセチル又は水酸基である。

【請求項7】
 
修飾フェニルアラニンがpara-azido-phenylalanine又は蛍光標識されたPheである請求項6記載の方法。

【請求項8】
 
N末にアルギニン又はリジン を有するタンパク質が任意の蛋白質をペプチダーゼにて処理して調製された請求項5から7のいずれか1項に記載の方法。

【請求項9】
 
(1)配列番号3で表されるアミノ酸配列において、415位のトレオニンをアラニン又はグリシンに変異させた変異型のPheRSαサブユニット、並びに
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のPheRSβサブユニットからなる変異PheRSであって、
tRNAPheをフェニルアラニンアナログ化できる変異PheRS。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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