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METHOD FOR PREPARING GENOME LIBRARY AND GENOME LIBRARY PREPARED BY THE SAME METHOD foreign

Patent code P110005471
Posted date Aug 18, 2011
Application number P2004-059900
Publication number P2005-245297A
Patent number P3972106
Date of filing Mar 3, 2004
Date of publication of application Sep 15, 2005
Date of registration Jun 22, 2007
Inventor
  • (In Japanese)嶋本 伸雄
  • (In Japanese)中山 秀喜
  • (In Japanese)荒牧 弘範
Applicant
  • (In Japanese)大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
Title METHOD FOR PREPARING GENOME LIBRARY AND GENOME LIBRARY PREPARED BY THE SAME METHOD foreign
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simply preparing a genome library from a sample in a trace amount and to provide the genome library prepared by the method.
SOLUTION: The first method for preparing the genome library comprises carrying out PCR by using a genome DNA itself of species to be targeted or its fragment as a direct template and using one kind of primer or a random primer composed of a specific sequence and proliferating the genome. The second method for preparing the genome library comprises carrying out pretreatment to the genome of the species, carrying out PCR by using a primer composed of one kind of intrinsic sequence and proliferating the genome. Both method enable simple preparation of the genome library from the sample in the trace amount.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

従来、ゲノムライブラリーを作製する方法としては、通常ショットガンクローニング法により、切断したゲノム断片をプラスミド、コスミド、ファージ、人工染色体ベクター等にクローニングする方法が用いられている。

しかしながら、上記従来の方法では制限酵素による切断処理やベクターにゲノム断片を組み込む処理など多くの処理が必要となるため、サンプル(試料)として大量のゲノムDNAを必要とし、煩雑な操作を伴うものであった。したがって、培養が困難な微生物の場合は、サンプルを多く得ることができず、ライブラリーの作製は困難であった。

一方、PCR(Polymerase Chain Reaction:ポリメラーゼ・チェーン・リアクション)を用いたゲノムライブラリー作製方法が、1997年にSingerらによって報告されている(下記の非特許文献1参照)。しかし、この方法も、制限酵素によって断片化した後、各ゲノム断片に対してリンカーを施す処理等を必要とし、PCRの前段階処理が非常に煩雑であった。そのため、これらの処理に伴うゲノムDNAの損失が避けられず、微少量サンプルから簡便にゲノムライブラリーを作製することは困難であった。また、この方法は、PCRにおいて複数種類のプライマーを使用するものであった。

【非特許文献1】
Nucleic Acids Research, vol.25, No.4 (1997) 781-786頁

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、微少量サンプルから簡便にゲノムライブラリーを作製する方法、および同方法により作製されたゲノムライブラリーに関する。本発明は、各種生物のゲノム解析用の研究材料、ゲノム創薬、その他生命科学諸分野の研究に広く利用し得るものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
任意の生物種のゲノムライブラリーを作製する方法であって、対象生物種のゲノムDNA又はその断片を鋳型とし、かつ、鋳型とアニーリングする3’末端側の少なくとも6merの領域が、対象生物種のゲノムにおいて出現頻度の高い配列の中から選択された1種類の特定の配列となるように設計されたプライマーのみを使用してPCRを行い、ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを作製する方法。

【請求項2】
 
3’末端側に出現頻度の高い配列を6mer以上含むと共に、5’末端側に対象生物種のゲノムにおいて出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するように設計したオリゴDNAをプライマーとして使用することを特徴とする請求項1記載のゲノムライブラリー作製方法。

【請求項3】
 
対象生物種のゲノムについて知られている配列情報をもとに、すべての6merの配列のうち出現頻度の高い1~20番目の配列の中から選択された6merの配列を3’末端側に含むオリゴDNAをプライマーとして使用することを特徴とする請求項1又は2記載のゲノムライブラリー作製方法。

【請求項4】
 
対象生物種のゲノムについて知られている配列情報をもとに、すべての10merの配列のうち出現頻度の高い1~20番目の配列の中から選択された10merの配列からなるオリゴDNAをプライマーとして使用することを特徴とする請求項1記載のゲノムライブラリー作製方法。

【請求項5】
 
請求項2記載の1種類の特定のプライマーを使用して第1のPCRを行った後、当該プライマーの5’末端側の固有配列を含む1種類のプライマーを使用して第2のPCRを行うことを特徴とするゲノムライブラリー作製方法。

【請求項6】
 
PCR条件として、アニーリング温度を30℃以上45℃以下にし、かつ、アニーリング温度から伸長反応温度までの温度上昇時間を5秒以上20分以下に設定したサイクルを含むことを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載のゲノムライブラリー作製方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered


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