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(In Japanese)ダイオキシン類等応答性プラスミド、ダイオキシン類等測定用遺伝子導入細胞、並びにそれを用いたダイオキシン類等検出方法及びバイオセンサー foreign

Patent code P110005748
File No. P04-002R
Posted date Sep 13, 2011
Application number P2006-513687
Patent number P4815602
Date of filing May 16, 2005
Date of registration Sep 9, 2011
International application number JP2005008875
International publication number WO2005113767
Date of international filing May 16, 2005
Date of international publication Dec 1, 2005
Priority data
  • P2004-153293 (May 24, 2004) JP
Inventor
  • (In Japanese)北村 正敬
  • (In Japanese)前田 秀一郎
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山梨大学
Title (In Japanese)ダイオキシン類等応答性プラスミド、ダイオキシン類等測定用遺伝子導入細胞、並びにそれを用いたダイオキシン類等検出方法及びバイオセンサー foreign
Abstract (In Japanese)ダイオキシン類及び/又は多環芳香族炭化水素に反応して活性化される遺伝子(以下、DRE遺伝子という。)と、前記DRE遺伝子の下流に分泌型マーカータンパク発現遺伝子とを含むプラスミドと、このプラスミドが導入され、ダイオキシン類及び/又は多環芳香族炭化水素に曝露されると分泌型マーカータンパクを分泌する遺伝子導入細胞の開発と、この遺伝子導入細胞を使ったバイオセンサーとを開発する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


現代社会の深刻な問題の一つである環境汚染への対応策を確立するためには、環境中の有害化学物質への曝露の程度を正確に評価することが必要である。このためには、簡便で、感度や再現性の高い有害化学物質の分析方法が確立されていることが不可欠である。



ダイオキシン類は、極微量で種々の有害作用を惹起する。従って、鋭敏かつ迅速にダイオキシン類を検出する方法の確立は、ダイオキシン類への曝露を正確に評価し、健康障害を予防するために、緊急の課題と考えられる。また、ダイオキシン類と同じように環境中の有害物質である多環芳香族炭化水素、及びこれらを複合的に含有するタバコ煙の生物学的毒性の総体的かつ定量的評価も大きな課題である。



環境中のダイオキシン類等を検出するための代表的な手法としては、内因性のバイオマーカー、例えば薬物代謝酵素であるチトクロームP-4501A1の利用、 培養細胞を用いたバイオアッセイ、酵素免疫アッセイ、クロマトグラフィーを用いた方法などがある。特に遺伝子工学技術を用いたバイオアッセイは、その簡便性と感度の高さから、近年注目を集めている。



こうした遺伝子工学的バイオアッセイは、幾つかの基本ユニットにより構成されている。かかる基本ユニットは、(1)細胞、(2)細胞に組み込む遺伝子構造の2つである。ここで、かかる遺伝子構造はさらにダイオキシン類のセンサーとして機能するDNA配列であるダイオキシン類応答DNA配列と、マーカータンパクを規定するマーカータンパク遺伝子とにより成り立っている。



こうした遺伝子構造を細胞に導入し、細胞の染色体DNAに安定に組み込むことにより、ダイオキシン類等に反応するセンサー細胞を作製することが可能である。



こうした遺伝子導入細胞がダイオキシン類等を含む試料に曝露されると、まずダイオキシン類等が細胞内のAhRと結合し、さらに転写促進共役因子であるコアクチベーター(以下、Arnt)と複合体を形成、その複合体が転写因子としてダイオキシン類応答DNA配列を活性化させる。その結果、遺伝子配列下流のマーカータンパク遺伝子の発現が促進される。



かかるマーカータンパク遺伝子が発現することによりマーカータンパクが産生され、当該タンパクを定量化することにより、試料中にどのくらいの濃度のダイオキシン類等が存在するかを評価することができる。



マーカータンパク遺伝子としては、これまでクロラムフェニコ-ル・アシルリボシル・トランスフェラ-ゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、などの酵素遺伝子や緑色螢光タンパク遺伝子が用いられてきた。



しかし、これまでのバイオアッセイでは、(1)マーカータンパクが分泌されないため、その定量のためには細胞を破壊してマーカータンパクを抽出する操作が必要、(2)環境中の極微量な有害物質を検出する上で感度が不十分であり、高感度なシステムでも2、3、7、8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(以下、TCDD)換算で1pMが検出の限界、(3)バイオアッセイに2日~3日必要、(4)1サンプルあたり60、000個から100、000個の細胞数が必要、このため、培養コスト、人件費などの経費が高くつく、などの問題点を挙げることができる。特に(2)~(4)は、多数のサンプルを効率良くスクリーニングしてゆく上で大きな障害となっていた。
【非特許文献1】
P.A. Behnisch、 K. Hosoe、 S. Sakai、 Bioanalytical screening methods for dioxins and dioxin-like compounds:a review of bioassay/biomarker technology、 Environ. Int. 27 (2001) 413-439.
【非特許文献2】
特願2004-135662「ダイオキシン類測定用形質転換体並びにそれを用いたダイオキシン類の検出方法、定量分析方法及びスクリーニング方法」

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、ダイオキシン類、多環芳香族炭化水素などの内分泌撹乱物質や一部の発がん物質等が、細胞内受容体である芳香族炭化水素受容体(以下、AhR)を介して作用することに基づく有害化学物質の簡便、迅速かつ高感度な検出方法または定量方法、及び検出物質、並びにダイオキシン類検出バイオセンサーに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
マウス乳癌ウイルスのプロモータ(以下、MMTVという。)の一部にダイオキシン類及び/又は多環芳香族炭化水素に反応して活性化される遺伝子(以下、DRE遺伝子という。)を組み込んだ遺伝子配列(以下、MMTV-DREという。)と、前記DRE遺伝子の下流に分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子とを含むプラスミドを、マウスの癌細胞株(Hepa-1c1c7)に導入したことを特徴とするダイオキシン類及び/又は多環芳香族炭化水素を測定するための遺伝子導入細胞。

【請求項2】
 
請求項1に記載の遺伝子導入細胞を含み、該遺伝子導入細胞をダイオキシン類及び/又は多環芳香族水素の検出に用いることを特徴とするバイオセンサー。

【請求項3】
 
請求項1に記載の遺伝子導入細胞を評価試料に曝露させたときに前記遺伝子導入細胞が分泌する分泌型マーカータンパクの活性を測定することによりダイオキシン類及び/又は多環芳香族水素を検出することを特徴とするダイオキシン類及び/又は多環芳香族炭化水素の検出方法。

【請求項4】
 
請求項1に記載の遺伝子導入細胞をタバコ煙に曝露させたときに前記遺伝子導入細胞が分泌する分泌型マーカータンパクの活性を測定することによりタバコ煙の生物学的毒性を評価することを特徴とするタバコ煙の生物学的毒性の評価方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
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