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METHOD FOR PURIFYING PROTEIN BY USING SOLID-SUPPORTED COBALT CARBONYL COMPLEX

Patent code P110006043
File No. E095P02
Posted date Dec 5, 2011
Application number P2010-112226
Publication number P2011-241155A
Patent number P5366260
Date of filing May 14, 2010
Date of publication of application Dec 1, 2011
Date of registration Sep 20, 2013
Inventor
  • (In Japanese)袖岡 幹子
  • (In Japanese)▲ど▼▲ど▼ 孝介
  • (In Japanese)濱島 義隆
  • (In Japanese)江上 寛通
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title METHOD FOR PURIFYING PROTEIN BY USING SOLID-SUPPORTED COBALT CARBONYL COMPLEX
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new method for purifying protein.
SOLUTION: The method for purifying protein uses the novel solid phase-supported cobalt carbonyl complex and a ligand having an alkyne tag.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

タンパク質の分離・精製は、生化学、分子生物学、ケミカルバイオロジー、プロテオミクス等の分野の最も基礎的な手技の一つである。タンパク質は種々のアミノ酸が脱水縮合した集合体であり、これに糖鎖や脂質が結合している場合がある。従って、これを分離・精製するときには、タンパク質の持つ、等電点、分子量、溶解度、特別な物質への親和性等を利用する。これまでに、多くのタンパク質の分離・精製法が知られており、それらは、硫安沈殿等の溶解度の差を利用した沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを包含する。タンパク質の分離・精製にあたっては、目的とするタンパク質の性質と夾雑物の種類により、上記精製法の何れか又はそれらを組み合わせた方法が採られる。医学・薬学・農学等のライフサイエンスの分野では、ある特定の生理的な機能に関与する標的タンパク質に対して高い親和性を有する特定の化合物(リガンド)を用いて、標的タンパク質を細胞抽出液のような複雑な混合物の中から精製し、その構造を決定することが必要となることがあり、このような目的のためには、アフィニィークロマトグラフィーが広く用いられている。しかし、従来のアフィニティークロマトグラフィーにおいては、リガンドを樹脂などの固相に共有結合で直接担持して用いるため、リガンドと標的タンパク質との結合能が低下し、十分な結果が得られない場合がある。又、固相に結合したリガンドは膜透過性が低いため、標的タンパク質と結合させるためには細胞や組織等の試料を予め粉砕したり抽出したりして前処理を施した後にアフィニティークロマトグラフィーに付す必要がある。しかし、生理的な機能に関与しているタンパク質は、生理的条件では、例えば膜に埋め込まれていたり、ホモダイマーやヘテロダイマー等の多量体を構成し、細胞内のタンパク質や脂質などの他の成分と複合体を作って、複雑な立体構造を形成している場合が多く、これらのタンパク質は破砕や抽出等の前処理を施すことにより本来の構造とは別の構造に変化してしまい、本来の結合能を保持していないために十分な結果が得られない場合がある。新しい原理に基づくタンパク質の分離・精製法は、既存の方法では困難な分離・精製を可能にする又はより容易な分離・精製法を提供する可能性があるため、そのような方法の開発が待ち望まれている。

ところでアルキンとジコバルトオクタカルボニルが選択的に反応してアルキン―ジコバルトヘキサカルボニル錯体が生成することは有機化学の分野では良く知られており、この反応はアルキンの保護、生成した複合体を中間体として用いるNicholas反応やPauson-Khand反応等の有機合成反応に応用されている(非特許文献1~5)。これらの反応は固相上でも進行することが知られている(非特許文献6)。これらの反応は通常は有機溶媒中・加熱条件下で行われ、タンパク質を扱う一般的条件である水溶液中・低温(例えば氷冷下)での反応は知られていない。最近、Brownらはアルキンを導入したリン脂質を、ジコバルトヘキサカルボニル錯体に誘導し、固相に担持したホスフィンと結合させて釣り上げる方法を発表した(非特許文献7)。しかし、この方法においても、アルキンを含有するリン脂質とジコバルトオクタカルボニルの反応は有機溶媒中・加熱条件下で行われており、タンパク質の精製に応用できる方法ではない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は固相担持コバルト・カルボニル錯体を用いたタンパク質の精製法に関する。より詳細には、本発明は、アルキンタグを有するリガンドを用いてタンパク質を精製する方法を提供する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下のステップ(i)~(iv):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドのリガンド部分と、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド-タンパク質複合体を生成するステップ、
(iii)固相担持コバルト・カルボニル錯体と、前記ステップ(ii)の前記リガンド-タンパク質複合体とを反応させてリガンド-タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(iv)ステップ(iii)のリガンド-タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含み、
固相担持コバルト・カルボニル錯体が下記の式
【化1】
 
(省略)
[式中、灰色の丸は固相を表し、Aはスペーサーを表し、Ar1、Ar2及びAr3は、それぞれ独立に1以上の低級アルキル、低級アルコキシ若しくはハロゲンで置換されている又は置換されていないアリールである]
により表されるものである、
固相担持コバルト・カルボニル錯体と、アルキンタグを有するリガンドとを用いることを特徴とするタンパク質の精製方法。

【請求項2】
 
以下のステップ(i)~(iv):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドのアルキンタグ部分と、固相担持コバルト・カルボニル錯体とを反応させてリガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、
(iii)前記ステップ(ii)の前記リガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体のリガンド部分と、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド-タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(iv)ステップ(iii)のリガンド-タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含み、
固相担持コバルト・カルボニル錯体が下記の式
【化2】
 
(省略)
[式中、灰色の丸は固相を表し、Aはスペーサーを表し、Ar1、Ar2及びAr3は、それぞれ独立に1以上の低級アルキル、低級アルコキシ若しくはハロゲンで置換されている又は置換されていないアリールである]
により表されるものである、
固相担持コバルト・カルボニル錯体と、アルキンタグを有するリガンドとを用いることを特徴とするタンパク質の精製方法。

【請求項3】
 
以下のステップ(i)~(v):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドのリガンド部分と、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド-タンパク質複合体を生成するステップ、
(iii)コバルト・カルボニル錯体と、前記ステップ(ii)の前記リガンド-タンパク質複合体のアルキンタグ部分とを反応させてリガンド-タンパク質複合体結合コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、
(iv)ステップ(iii)のリガンド-タンパク質複合体結合コバルト・カルボニル錯体と固相に担持したホスフィンを反応させてリガンド-タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(v)ステップ(iv)のリガンド-タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含み、
該リガンド-タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体中のリガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体が下記の式
【化3】
 
(省略)
[式中、灰色の丸は固相を表し、黒丸はリガンドを表し、Aはスペーサーを表し、Bはリンカーを表し、Ar1、Ar2及びAr3は、それぞれ独立に1以上の低級アルキル、低級アルコキシ若しくはハロゲンで置換されている又は置換されていないアリールであり、並びにリガンドはタンパク質と結合可能なものである。]
により表されるものである、
固相担持コバルト・カルボニル錯体と、アルキンタグを有するリガンドとを用いることを特徴とするタンパク質の精製方法。

【請求項4】
 
洗浄を行うステップをさらに含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
 
下記の式
【化4】
 
(省略)
[式中、灰色の丸は固相を表し、黒丸はリガンドを表し、Aはスペーサーを表し、Bはリンカーを表し、Ar1、Ar2及びAr3は、それぞれ独立に1以上の低級アルキル、低級アルコキシ若しくはハロゲンで置換されている又は置換されていないアリールであり、並びにリガンドはタンパク質と結合可能なものである。]
により表される、タンパク質を精製するためのリガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体。

【請求項6】
 
下記の式
【化5】
 
(省略)
[式中、灰色の丸は固相を表し、Aはスペーサーを表し、Ar1、Ar2及びAr3は、それぞれ独立に1以上の低級アルキル、低級アルコキシ若しくはハロゲンで置換されている又は置換されていないアリールである]
により表される、固相担持コバルト・カルボニル錯体と、下記の式:
【化6】
 
(省略)
[式中、黒丸はタンパク質と結合可能なリガンドを表し、Bはリンカーを表し、≡はアルキニル基を表す]
であるアルキンタグを有するリガンドとを含んでなる、タンパク質の精製用のキット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2010112226thum.jpg
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) ERATO SODEOKA Live Cell Chemistry AREA
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