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非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法、及びその利用 新技術説明会 実績あり 外国出願あり

国内特許コード P120006443
整理番号 07783
掲載日 2012年1月10日
出願番号 特願2012-520488
登録番号 特許第5858543号
出願日 平成23年6月16日(2011.6.16)
登録日 平成27年12月25日(2015.12.25)
国際出願番号 JP2011063778
国際公開番号 WO2011158895
国際出願日 平成23年6月16日(2011.6.16)
国際公開日 平成23年12月22日(2011.12.22)
優先権データ
  • 特願2011-047663 (2011.3.4) JP
  • 特願2010-137635 (2010.6.16) JP
発明者
  • 横山 茂之
  • 向井 崇人
  • 坂本 健作
  • 松元 明子
出願人
  • 国立研究開発法人理化学研究所
発明の名称 非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法、及びその利用 新技術説明会 実績あり 外国出願あり
発明の概要 (1)UAGコドンを認識するtRNAを細菌内に発現させ、(2)前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を細菌内に発現させ、(3)UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物を細菌に導入する及び/又は細菌染色体上の前記選択される遺伝子に、当該遺伝子の機能を翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入し、(4)翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させることにより、新規な非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法を提供する。
従来技術、競合技術の概要

非天然タンパク質(又は超タンパク質)と呼ばれる、所望の位置のアミノ酸残基を非天然型アミノ酸及び/又はα―ヒドロキシ酸で置換したタンパク質がある。この非天然タンパク質は、天然タンパク質に存在しない新しい生理活性、触媒活性、構造及び機能を有する。そのため、非天然タンパク質の合成は、従来のタンパク質工学における制約を乗り越える必要不可欠な基盤技術となる。

近年では、大腸菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳類細胞を用いて非天然タンパク質を合成することが可能である。このような合成システムにおいて、非天然型アミノ酸が非特異的な位置に導入されることは望ましくないため、一般的には、ストップコドンの一つであるアンバーコドン(UAGコドン)に非天然型アミノ酸が導入される。

アンバーコドンへの非天然型アミノ酸の導入は、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子と競合することが知られており、非特許文献1、2では、大腸菌の翻訳終結因子であるRF-1の活性を弱めることによって、非天然型アミノ酸の導入効率が改善されること、非特許文献3では、無細胞タンパク質合成系においてRF-1の量を減らすことによって、アンバーコドンへ効率よく非天然型アミノ酸が導入されることが報告されている。

さらに、RF-1をコードするprfA遺伝子を欠損させることで非天然型アミノ酸の導入効率をさらに改善できると考えられる。ここで、prfA遺伝子を欠損させる方法として、非特許文献4では、ゲノム上の全ての遺伝子のアンバーコドンをオーカーコドン又はオパールコドンに置き換える方法が開示されている。また、非特許文献5、6では、アンバーコドンを全てオーカーコドンに置き換え、prfA遺伝子を欠損させた大腸菌が報告されている。

産業上の利用分野

本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法、非天然タンパク質製造用の組換え細菌を作製するためのDNA構築物、非天然タンパク質製造用の組換え細菌、組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法、非天然タンパク質の製造に用いる組換え細菌の抽出物に関する。特に、本発明は、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損した組換え細菌の作製方法、該遺伝子を欠損させるためのDNA構築物、該遺伝子が欠損した組換え細菌、該遺伝子が欠損した組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法、該遺伝子が欠損した組換え細菌の抽出物に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
(1)UAGコドンを認識するtRNAを細菌内に発現させるステップと、
(2)前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を細菌内に発現させるステップと、
(3)UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を細菌に対して行うステップと、
(4)細菌内の前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、
を含み、
前記(1)~(4)のステップにおける前記各細菌は全て同一の細菌であり、
前記細菌は、大腸菌または枯草菌であり、
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolA、並びに枯草菌のaccD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの中から選択される1以上の遺伝子であり、
前記処理が、前記1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物を前記細菌に導入する処理及び/又は前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であ
前記DNA構築物は、前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えた前記1以上の遺伝子の改変型遺伝子を含み、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換える改変である、作製方法。

【請求項2】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
UAGコドンを認識するtRNAを発現する細菌に対して、
(5)前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現させるステップと、
(6)UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を行うステップと、
(7)前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、を含み、
前記細菌は、大腸菌または枯草菌であり、
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolA、並びに枯草菌のaccD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの中から選択される1以上の遺伝子であり、
前記処理が、前記1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物を前記細菌に導入する処理及び/又は前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であ
前記DNA構築物は、前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えた前記1以上の遺伝子の改変型遺伝子を含み、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換える改変である、作製方法。

【請求項3】
前記細菌が、UAGコドンを認識するtRNAであって前記アミノアシル-tRNA合成酵素によってはアシル化されないtRNAを発現しており、
当該tRNAをコードする遺伝子を欠損させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の作製方法。

【請求項4】
前記非天然タンパク質が非天然型アミノ酸あるいはα-ヒドロキシ酸を含む非天然タンパク質であることを特徴とする請求項1又は2に記載の作製方法。

【請求項5】
前記細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項1~4の何れか1項に記載の作製方法。

【請求項6】
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolAの中から選択される任意の6つの遺伝子であることを特徴とする請求項1~5の何れか1項に記載の作製方法。

【請求項7】
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、hda、mreC及びhemAの遺伝子であることを特徴とする請求項に記載の作製方法。

【請求項8】
前記1以上の遺伝子として、遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が低下する遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項6または7に記載の作製方法。

【請求項9】
遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が低下する上記遺伝子が、大腸菌のsucB遺伝子であることを特徴とする請求項に記載の作製方法。

【請求項10】
前記細菌が大腸菌であり、
前記DNA構築物は、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolAの中から選択される1以上の遺伝子の機能を発現するDNA構築物であることを特徴とする請求項1~の何れか1項に記載の作製方法。

【請求項11】
前記DNA構築物は、さらに大腸菌のsucB遺伝子の機能を発現するDNA構築物であることを特徴とする請求項10に記載の作製方法。

【請求項12】
前記DNA構築物は、細菌染色体にトランス及び/又はシスに補充されるバクテリア人工染色体、プラスミドあるいは直鎖状DNAであることを特徴とする請求項1~11のいずれか1項に記載の作製方法。

【請求項13】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌を作製するためのDNA構築物であって、
UAGコドンを認識するtRNA及び前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素の存在下において、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現し、
前記組換え細菌は、大腸菌由来または枯草菌由来であり、
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolA、並びに枯草菌のaccD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの中から選択される1以上の遺伝子であり、
前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えた前記1以上の遺伝子の改変型遺伝子を含むことを特徴とするDNA構築物。

【請求項14】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌であって、
UAGコドンを認識するtRNAを発現すること
前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現すること
UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物が導入されていること、及び/又は細菌染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていることと、
前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していることと、
前記組換え細菌は、大腸菌由来または枯草菌由来であり、
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolA、並びに枯草菌のaccD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの中から選択される1以上の遺伝子であること、
前記DNA構築物は、前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えた前記1以上の遺伝子の改変型遺伝子を含むことと、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換える改変であることと、
を特徴とする組換え細菌。

【請求項15】
前記組換え細菌が大腸菌由来であることを特徴とする請求項14に記載の組換え細菌。

【請求項16】
組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法であって、
(a)非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシル-tRNA合成酵素と、
(b)前記アミノアシル-tRNA合成酵素の存在下において非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸と結合可能な、UAGコドンを認識するtRNAと、
(c)ランダムに、あるいは所望の位置に1つ以上のナンセンス変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、
を請求項14に記載の組換え細菌又は当該組換え細菌の抽出液内で発現させることを特徴とする非天然タンパク質の製造方法。

【請求項17】
前記組換え細菌が大腸菌由来であることを特徴とする請求項16に記載の非天然タンパク質の製造方法。

【請求項18】
非天然タンパク質の製造に用いる組換え細菌の抽出物であって、
前記組換え細菌が、
大腸菌由来または枯草菌由来であることと、
UAGコドンを認識するtRNAを発現すること
前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現すること
UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物が導入されていること、及び/又は細菌染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていること
前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していること
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolA、並びに枯草菌のaccD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの中から選択される1以上の遺伝子であることと、
前記DNA構築物は、前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えた前記1以上の遺伝子の改変型遺伝子を含むことと、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換える改変であることと、
を特徴とする抽出物。

【請求項19】
前記組換え細菌が大腸菌由来であることを特徴とする請求項18に記載の抽出物。
国際特許分類(IPC)
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