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ENZYME ACTIVITY-MEASURING SUBSTRATE USING FRET, AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME meetings

Patent code P120007139
File No. 1003-69
Posted date Apr 2, 2012
Application number P2010-068027
Publication number P2011-201943A
Patent number P5697129
Date of filing Mar 24, 2010
Date of publication of application Oct 13, 2011
Date of registration Feb 20, 2015
Inventor
  • (In Japanese)松岡 浩司
  • (In Japanese)荒井 啓克
  • (In Japanese)岡 博之
  • (In Japanese)幡野 健
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人埼玉大学
Title ENZYME ACTIVITY-MEASURING SUBSTRATE USING FRET, AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an enzyme substrate in a polymer form using FRET and a method for producing the same.
SOLUTION: There is provided a method for producing an enzyme substrate in a polymer form by copolymerizing a polymerizable compound to which a fluorescence donor of FRET is bonded, a polymerizable compound to which a fluorescence acceptor of FRET is bonded, and a polymerizable compound to which neither the fluorescence donor of FRET nor the fluorescence acceptor of FRET is bonded. Any one bond of the fluorescence donor of FRET or the fluorescence acceptor of FRET is a bond through the enzyme substrate part. There is also provided an enzyme substrate synthesized by the production method.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET; Fluorescence Resonance Energy Transfer)を誘導する分子は、ストライヤーらにより分子定規として初めて合成され、以来、様々な分野においてその効果が利用されている。ストライヤーらによって合成された分子は、100Å以内の鎖長となるペプチドの両末端に蛍光ドナーと蛍光アクセプター導入したもので、ドナーからの蛍光をアクセプターが吸収し、ドナーとは異なる波長の蛍光を発するものである。このペプチドが鎖内で切断されると、ドナーからの蛍光をアクセプターが吸収できなくなるため、アクセプターからの蛍光が検出されなくなり、代わりにドナーからの蛍光が検出されるようになる。このように、ペプチドの切断により分子から発せられる蛍光の波長が変化するため、この波長変化を利用するとペプチダーゼなどの酵素活性を測定することが可能となる。
これまでに、FRETを利用した酵素活性の測定方法、並びに酵素基質に関する報告は数多く知られている(特許文献1、特許文献2、非特許文献1及び非特許文献2など)。このようなFRETを利用した酵素基質及び酵素活性測定方法は、比較的検出感度が高いなどの利点を有する反面、基質の製造及び精製段階が煩雑であり、コストの面においても負担が大きいなど、改善すべき点も多く指摘されている。

これまでに報告のあるFRET を利用した酵素基質は、比較的低分子のものがほとんどで、ポリマー状の基質で実用的なものはこれまでにほとんど知られていない。例えば、FRETではなく、蛍光寿命の増減を検出して酵素活性を測定するポリマー状の基質の報告は存在するが、感度の点において、FRETには劣ることが予想される(特許文献3)。
以上のようにFRETは酵素活性の基質に応用する技術として、極めて優れた技術ではあるが、検出可能なFRETを惹起する基質を簡易にしかも低コストで製造する実用的な方法は、これまでの所知られていない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、酵素の基質及びその製造方法に関する。より具体的には、FRETを利用した酵素の基質及びその製造方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の式(VI)のポリマー形態の酵素基質。
【化1】
 
(省略)
(式(VI)中、xは1、yは105以下の整数、zは5以下の整数である。)

【請求項2】
 
請求項1に記載の基質を含む酵素活性測定用キット。

【請求項3】
 
FRETの蛍光ドナーが結合している重合性化合物を以下の式(II)の化合物、FRETの蛍光アクセプターが結合している重合性化合物が以下の式(III)の化合物、並びに、FRETの蛍光ドナー及びFRETの蛍光アクセプターのいずれも結合していない重合性化合物をアクリルアミドとして、共重合させてポリマー形態の酵素基質を1工程で製造する方法。
【化2】
 
(省略)

【請求項4】
 
前記共重合が、ラジカル重合であることを特徴とする請求項3に記載の製造方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2010068027thum.jpg
State of application right Registered
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