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THREE-DIMENSIONAL CONFOCAL OBSERVATION APPARATUS AND OBSERVATION FOCAL PLANE DISPLACEMENT AND CORRECTION UNIT

Patent code P120007171
File No. AF02P009
Posted date Apr 3, 2012
Application number P2010-208971
Publication number P2012-063668A
Patent number P5221614
Date of filing Sep 17, 2010
Date of publication of application Mar 29, 2012
Date of registration Mar 15, 2013
Inventor
  • (In Japanese)生田 幸士
  • (In Japanese)池内 真志
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title THREE-DIMENSIONAL CONFOCAL OBSERVATION APPARATUS AND OBSERVATION FOCAL PLANE DISPLACEMENT AND CORRECTION UNIT
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a three-dimensional confocal observation apparatus capable of obtaining a three-dimensional image of a sample without affecting an optical trap during operation of the sample with the use of optical tweezers.
SOLUTION: The three-dimensional confocal observation apparatus constituted by combining a confocal microscope and an optical tweezers technology has a pair of lenses for focal plane displacement of which one lens can be moved in an optical axis direction arranged between a fixed objective lens and a camera for fluorescent imaging, and includes means of correcting distortion of fluorescent confocal images obtained by the camera for fluorescent imaging.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

生物学等の分野では、従来より、例えば下記の特許文献1に示されるように、透明なマイクロビーズを液中に投入して、集光した赤外レーザー光の焦点位置で捕捉し、そのマイクロビーズを介して液中でDNAや生体分子、細胞等を操作する、光ピンセットと呼ばれる手法が用いられている。又、下記の特許文献2には、2光子吸収光造形法により作製された全長10μmサイズの樹脂製の微小構造体を対象物として、この対象物を液中で光ピンセットによって駆動させ、細胞の操作や力計測に用いる技術が開示されている。

このような光ピンセットの手法では、対象物(試料)が非常に微小であるため、液中の対象物を顕微鏡下で観察しながら操作する必要がある。その場合、通常の顕微鏡では光ピンセットの対象物を2次元的にしか観察できないため、対象物と光トラップの焦点位置との上下関係を把握し難く、精確な操作ができないという問題がある。

一方、観察対象物を3次元的に観察する顕微鏡として、従来、共焦点顕微鏡が用いられている。共焦点顕微鏡では、試料(蛍光染色を行った観察対象物)上に対物レンズを通して励起用レーザー光を集光照射し、試料から発せられた蛍光を対物レンズと共役な位置に配置したピンホールを通過させて検出器上に結像させる。対物レンズの焦点以外から発せられた光はピンホールによって除去されるため、焦点領域の光のみを検出することができる。そして、励起用レーザー光の集光点をガルバノミラーや音響光学素子により試料上で2次元的に走査することによって、試料の特定深さ近傍の薄い断面像を得ることができる。更に、対物レンズまたは試料ステージを光軸方向に走査することにより、異なる深さでの断面像を得ることができる。従って、試料の3次元画像を構築することができる。

又、上記のような共焦点顕微鏡において、例えば下記の特許文献3、4に示されるように、試料上の2次元走査を高速化するために、ニッポウディスクやマイクロレンズアレイを用いて、励起用レーザー光を多数本に分割し、試料上の複数の領域を同時に走査する方法が知られている。同様な目的から、例えば下記の特許文献5に示されるように、励起用レーザー光をライン状に集光して走査するラインスキャン型走査系が用いられることもある。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は3次元共焦点観察用装置及び観察焦点面変位・補正ユニットに関する。更に詳しくは、本発明は、いわゆる共焦点顕微鏡と光ピンセット技術を組み合わせると共に、このような組み合わせにおいて生じる新規な課題に対応した3次元共焦点観察用装置と、この装置における新規な構成の要部である観察焦点面変位・補正ユニットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
共焦点観察励起用の第1のレーザーの光源と、前記第1のレーザーを試料上で走査するための2次元走査光学系と、前記光源から供給される第1のレーザーを観察対象物たる蛍光性の試料上に集光する対物レンズと、前記蛍光性の試料から発せられた蛍光に基づいて蛍光共焦点像を検出する蛍光撮像用カメラとを備えた3次元共焦点観察用装置において、
前記対物レンズと蛍光撮像用カメラとの間には、前記試料の蛍光共焦点像の中間像を結ぶ中間結像レンズと、この中間結像レンズに対して同一光軸上で焦点位置が重なるように配置される中間対物レンズからなり、かつこれらの内の少なくとも一方のレンズがレンズ駆動手段によって光軸方向に移動可能とされている焦点面変位用レンズペアを配置し、又、
前記蛍光撮像用カメラにより得られた蛍光共焦点像と、サンプル試料の予備計測により予め取得された歪補正用データとを用いて、前記焦点面変位用レンズペアにおけるレンズの移動に起因する蛍光共焦点像の歪みをリアルタイムに補正して試料の3次元構築画像を得る演算手段を備えた計算機と、前記演算手段により得られた補正画像を表示する手段とを設け、更に、
前記焦点面変位用レンズペアと前記対物レンズとの間にビームスプリッタ又はダイクロイックミラーを備えさせ、光ピンセット用の第2のレーザーの光源から供給される第2のレーザーが、前記ビームスプリッタ又はダイクロイックミラーを介して、前記対物レンズを通過し試料上に集光される構成としたことを特徴とする3次元共焦点観察用装置。

【請求項2】
 
前記2次元走査光学系がニッポウディスクあるいはラインスキャン型走査系を備えることを特徴とする請求項1に記載の3次元共焦点観察用装置。

【請求項3】
 
前記焦点面変位用レンズペアのレンズ駆動手段が、ピエゾ素子、磁歪素子、ボイスコイルのいずれかであることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の3次元共焦点観察用装置。

【請求項4】
 
前記焦点面変位用レンズペアにおけるレンズ駆動手段の駆動と、蛍光撮像用カメラによる画像取得とのタイミングが同期するように調整されていることを特徴とする請求項1~請求項3のいずれかに記載の3次元共焦点観察用装置。

【請求項5】
 
前記試料の3次元構築画像を得る演算手段による演算をGPUによって行うものであることを特徴とする請求項1~請求項4のいずれかに記載の3次元共焦点観察用装置。

【請求項6】
 
前記3次元共焦点観察用装置が、更に、対物レンズと焦点面変位用レンズペアとの間に配置したビームスプリッタ又はダイクロイックミラーと、これらのビームスプリッタ又はダイクロイックミラーによって分離された試料の2次元画像を撮影するための結像レンズ及び明視野観察用カメラを備えることを特徴とする請求項1~請求項5のいずれかに記載の3次元共焦点観察用装置。

【請求項7】
 
共焦点観察励起用のレーザーの光源と、この光源から供給されるレーザーを蛍光性の試料上に集光する対物レンズと、前記試料から発せられた蛍光に基づいて蛍光共焦点像を検出する蛍光撮像用カメラとを備えた3次元共焦点観察用装置における前記対物レンズと前記蛍光撮像用カメラとの間に設置するユニットであって、
前記試料の蛍光共焦点像の中間像を結ぶ中間結像レンズと、この中間結像レンズに対して同一光軸上で焦点位置が重なるように配置される中間対物レンズからなり、かつこれらの内の少なくとも一方のレンズがレンズ駆動手段によって光軸方向に移動可能とされている焦点面変位用レンズペアを備え、更に、
前記蛍光撮像用カメラにより得られた蛍光共焦点像と、サンプル試料の予備計測により予め取得された歪補正用データとを用いて、前記焦点面変位用レンズペアにおけるレンズの移動に起因する蛍光共焦点像の歪みをリアルタイムに補正して試料の3次元構築画像を得る演算手段を備えた計算機と、前記演算手段により得られた補正画像を表示する手段とを備えていることを特徴とする観察焦点面変位・補正ユニット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2010208971thum.jpg
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Novel Measuring and Analytical Technology Contributions to the Elucidation and Application of Life Phenomena AREA
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