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凍結保存可能な小型肝細胞の調製方法、およびその凍結保存方法 実績あり

国内特許コード P120007210
整理番号 8009
掲載日 2012年4月5日
出願番号 特願2002-500674
登録番号 特許第4998969号
出願日 平成13年5月30日(2001.5.30)
登録日 平成24年5月25日(2012.5.25)
国際出願番号 JP2001004555
国際公開番号 WO2001092481
国際出願日 平成13年5月30日(2001.5.30)
国際公開日 平成13年12月6日(2001.12.6)
優先権データ
  • 特願2000-164158 (2000.6.1) JP
発明者
  • 三高 俊広
出願人
  • 北海道公立大学法人 札幌医科大学
発明の名称 凍結保存可能な小型肝細胞の調製方法、およびその凍結保存方法 実績あり
発明の概要 小型肝細胞の有する肝細胞の機能および増殖能を維持させ得る凍結保存方法に適した、小型肝細胞の調製方法が提供される。また、そのように調製した小型肝細胞の凍結保存方法、および、肝機能および増殖能を維持したまま凍結保存された小型肝細胞が提供される。本発明においては、小型肝細胞をニコチンアミドを添加した培養液を用いて培養し、非実質細胞に包囲された小型肝細胞コロニーを形成させ、形成されたコロニーを非酵素的処理によって小型肝細胞塊として培養皿から剥がし、これを凍結保存用溶液中に懸濁し、凍結保存する。
従来技術、競合技術の概要


本発明は、凍結保存用小型肝細胞の調製方法および、小型肝細胞の凍結保存方法に関する。
肝臓および肝細胞は体内における化学工場と言われるほど多様な機能を持っている。例えば、血清タンパク質の90%以上は肝細胞が産生しており、体内に取り込まれたり産生された有害物質を代謝する解毒機能を有している。そのため、肝細胞を培養し、その持っている機能を使って有害物資の検出(バイオセンサー)、ヒトに必要な物質の体外生産を可能にしようと様々な研究機関で研究がなされている。それらの研究に用いる肝細胞を供給するためには、現在のところ分化した肝細胞機能を保持している細胞株は存在していないため、実験毎に成熟肝細胞を単離しなければならない。このような場合には、得られる細胞数は個々の個体の肝細胞数に依存する。なぜなら、肝細胞の機能を維持したまま、成熟細胞を増殖させる方法が十分に確立しているわけではないからである。
また、細胞組込み型の人工肝臓の開発においても成熟肝細胞機能の多くを有する細胞の恒常的な大量供給が望まれている。従って、ヒトを含めて動物の肝細胞を冷凍し、長期保存し、再び使用する方法の開発は非常に重要な課題であって、世界中でなされているが、これまでに冷凍保存後、解凍した肝細胞が培養皿上に生着し、肝細胞としての機能の70~80%程度を短期間保持できることが報告されているのみである。しかも、これらの報告においては、解凍された肝細胞はほとんど増殖能を有せず、短期間に死滅した。
一方、発明者らは、肝臓組織内に、アルブミン、トランスフェリン、サイトケラチン(CK)8、CK18などのマーカーについて成熟肝細胞とほぼ同様の表現型を示し、超微構造的にも肝細胞としての特徴を有するが、増殖能の高い小型の細胞からなる細胞集団があることを報告し、これを「小型肝細胞」(small hepatocyte)と命名した(Mitaka T.ら、Hepatology,16,440-447,(1992))。
このような研究が行なわれる中で、簡便な方法により冷凍保存可能で、かつ、解凍後に増殖し、長期間肝細胞としての機能が保持され、または増強される細胞の調製方法、および、そのような細胞の冷凍保存方法は依然として報告されていなかった。

特許請求の範囲 【請求項1】
(i)採取された肝臓組織より肝細胞を分離すること、
(ii)分離された前記肝細胞を、実質細胞をより多く含む重量画分と、非実質細胞をより多く含み実質細胞をより少なく含む軽量画分とに分画し、前記軽量画分を回収すること、および、
(iii)前記軽量画分中の細胞をニコチンアミドを添加した培養液を用いて培養し、非実質細胞に包囲された小型肝細胞コロニーを形成させること、
(iv)(iii)で得られる非実質細胞に包囲されたコロニーを形成している小型肝細胞を、酵素を作用させ、または、作用させずに培養皿から剥離し、小型肝細胞の周囲を非実質細胞が取り囲んだ小型肝細胞塊として回収すること、
を含む、凍結保存用小型肝細胞の調製方法。

【請求項2】
請求項1の(iii)で得られる非実質細胞に包囲されたコロニーを形成している小型肝細胞および非実質細胞をニコチンアミドを添加した培養液を用いて継代培養し、非実質細胞に包囲された小型肝細胞コロニーを形成させること、および、
前記コロニーを形成している小型肝細胞を、酵素を作用させ、または、作用させずに培養皿から剥離し、小型肝細胞の周囲を非実質細胞が取り囲んだ小型肝細胞塊として回収すること、
更に含む、請求項1記載の凍結保存用小型肝細胞の調製方法。

【請求項3】
(i)請求項1の(iii)で得られる非実質細胞に包囲されたコロニーを形成している小型肝細胞、または、請求項1の(iii)で得られる非実質細胞に包囲されたコロニーを形成している小型肝細胞および非実質細胞をニコチンアミドを添加した培養液を用いて継代培養して得られる非実質細胞に包囲された小型肝細胞を、小型肝細胞の周囲を非実質細胞が取り囲んだ小型肝細胞塊として培養皿から剥離すること、
(ii)前記小型肝細胞塊を凍結保存用溶液中に懸濁すること、
(iii)前記懸濁された小型肝細胞塊を凍結チューブに移し、凍結させること、
(iv)前記凍結小型肝細胞塊細胞を、凍結保存すること、
を含む、小型肝細胞の凍結保存方法。

【請求項4】
凍結が、(i)-10℃~-30℃における凍結、および、(ii)-50℃~-90℃または液体窒素中における凍結、の2段階で行なわれ、凍結保存が-50℃~-90℃または液体窒素中で行なわれることを特徴とする、請求項3に記載の、小型肝細胞の凍結保存方法。

【請求項5】
培養皿からの小型肝細胞塊の剥離が非酵素的に行なわれること特徴とする、請求項3または4に記載の小型肝細胞の凍結保存方法。

【請求項6】
小型肝細胞がヒト小型肝細胞である、請求項1または2に記載の、小型肝細胞の調製方法。

【請求項7】
小型肝細胞がヒト小型肝細胞である、請求項3~5いずれか1項に記載の、凍結保存方法。

【請求項8】
請求項3~5または7のいずれか1項に記載の保存方法によって凍結保存された、小型肝細胞の周囲を非実質細胞が取り囲んだ小型肝細胞塊。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2002500674thum.jpg
出願権利状態 登録


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