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METHOD FOR MEASURING ENZYME ACTIVITY AND REAGENT KIT FOR MEASUREMENT

Patent code P120007351
File No. PG06E65JP
Posted date Apr 23, 2012
Application number P2006-097769
Publication number P2007-267680A
Patent number P4505651
Date of filing Mar 31, 2006
Date of publication of application Oct 18, 2007
Date of registration May 14, 2010
Inventor
  • (In Japanese)山口 昌樹
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人富山大学
Title METHOD FOR MEASURING ENZYME ACTIVITY AND REAGENT KIT FOR MEASUREMENT
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide means for simply and easily measuring activity of enzymes existing in biological samples such as saliva, especially means (method, reagent) for measuring samples containing high concentration enzymes, without diluting.
SOLUTION: In an enzymic method using a modified substrate, the enzyme activity of high activity value enzyme samples is directly measured, without diluted, by adding a competitive inhibitor which is competitive to the substrate and has similar molecular structure to that of the substrate, and a growth inhibitor which inhibits growth of products and has a similar molecular structure to that of the products.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


アミラーゼ(酵素番号EC3.2.1.1)は膵・唾液腺などで分泌され、主に唾液腺・膵に分布し、その他にも筋肉・卵巣・卵管などに存在していることが知られており、組織から逸脱したアミラーゼが血中や尿中に存在していることも知られている。一部の膵臓・唾液腺、腎・肝機能障害、腫瘍などの疾患においては、血清中や尿中・膵液中のアミラーゼ値が高値を示すことが知られている。これらのアミラーゼ活性の測定方法としては、従来よりCaraway法やオリゴ糖基質を用いた酵素法などが知られている。これらの方法はいずれも数千IU/Lまでのアミラーゼ活性を測定でき、正常値が数十から数百IU/L程度の血清・膵液・尿試料などの測定に用いられてきた。



近年の研究より、唾液アミラーゼ活性値が、被験者のストレスと相関しているとの報告がされており〔非特許文献1〕、唾液試料中のアミラーゼ活性値を測定する方法が望まれている。
しかしながら、唾液中のアミラーゼ活性値は、正常値が数万IU/Lとなるため、従来のアミラーゼ測定法では直接測定することは不可能であった。そのため、試料を希釈するなどの余分な操作が必要となるうえ、数百倍の希釈が必要なため測定精度の低下を招くという問題点が存在する。つまり,必要とされる分析範囲や,リニアリティの良好な検量線を実現するのが困難であった。
【非特許文献1】
医用電子と生体工学 39(3), p234-239(2001)、山口昌樹 他

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は酵素活性の測定試薬キット及び測定方法に関する。詳しくは、生物学的試料の酵素活性を希釈することなく直接測定する試薬及び方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
基質である修飾オリゴ糖、この基質と拮抗して競合的に作用する競合阻害剤であるオリゴ糖、及びアミラーゼによって産生される反応生成物の生成阻害剤である単糖もしくはオリゴ糖を少なくとも反応系に含み、競合阻害剤の基質に対するモル比が1/10~1、生成阻害剤の基質に対するモル比が1/5~1で支持体に担持されていることを特徴とする唾液中のアミラーゼ活性測定方法。

【請求項2】
 
合阻害剤と生成阻害剤の添加によって、アミラーゼ活性の測定範囲もしくはリニアリティーが改善される請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
競合阻害剤の基質に対するモル比が1/10~1/2である請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
 
生成阻害剤の基質に対するモル比が1/5~1/2である請求項1~3れか一に記載の方法。

【請求項5】
 
基質を1 ~ 100 mM、競合阻害剤を0.25 ~ 25 mM、生成阻害剤を0.4 ~ 40 mMの比率で含有する請求項1~4の何れか一に記載の方法。

【請求項6】
 
基質である修飾オリゴ糖が、G2~7から選ばれるオリゴ糖であって、還元末端を色原体で修飾されている請求項1~5の何れか一に記載の方法。

【請求項7】
 
色原体が、4-ニトロフェノール(PNP)、2-クロロ-4-ニトロフェノール(CNP)、2,4-ジクロロフェノール(Cl2P)から選ばれる請求項6に記載の方法。

【請求項8】
 
修飾オリゴ糖が、以下から選ばれる請求項1~7の何れか一に記載の方法;
2-クロロ-4-ニトロフェノール-4-O-β-D-ガラクトピラノシルマルトサイド(以
下 GAL-G2-CNP)、GAL-G4-CNP、GAL-G5-CNP、G5-C
NP、G6-CNP、G7-CNP、G5-PNP、G7-PNP。

【請求項9】
 
競合阻害剤であるオリゴ糖が、三糖以上である請求項1~8の何れか一に記載の方法。

【請求項10】
 
競合阻害剤であるオリゴ糖がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオー
スから選ばれる請求項9に記載の方法。

【請求項11】
 
生成阻害剤が、2種類以上添加される請求項1~10の何れか一に記載の方法。

【請求項12】
 
生成阻害剤が、グルコース、マルトース、マルトトリオースおよびマルトテトラオースから選ばれる少なくとも一である請求項1~11の何れか一に記載の方法。

【請求項13】
 
修飾オリゴ糖がGAL-G2-CNP、競合阻害剤がマルトペンタオース、生成阻害がマルトースである請求項1~12の何れか一に記載の方法。

【請求項14】
 
唾液を希釈することなく直接測定する請求項1~13の何れか一に記載の方法。

【請求項15】
 
請求項1~14の方法に使用する基質、競合阻害剤及び生成阻害剤が少なくとも含まれる
アミラーゼ活性測定用試薬キット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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