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METHOD FOR PRODUCING CULTURED MULTILAYER EPITHELIUM SHEET

Patent code P120007364
File No. H18-15
Posted date Apr 23, 2012
Application number P2007-040378
Publication number P2008-199972A
Patent number P5181172
Date of filing Feb 21, 2007
Date of publication of application Sep 4, 2008
Date of registration Jan 25, 2013
Inventor
  • (In Japanese)二階堂 敏雄
  • (In Japanese)岡部 素典
  • (In Japanese)齋藤 滋
  • (In Japanese)倉科 憲治
  • (In Japanese)小池 剛史
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人富山大学
  • (In Japanese)国立大学法人信州大学
  • (In Japanese)サクラ精機株式会社
Title METHOD FOR PRODUCING CULTURED MULTILAYER EPITHELIUM SHEET
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing a cultured multilayer epithelium sheet using a dried amnionic membrane produced by a specific drying method.
SOLUTION: A dried amnionic membrane keeping the cellular tissue of a raw amnionic membrane is obtained by continuously heating a raw amnionic membrane placed in a processing tank by a far-infrared heater provided in the processing tank, pressure-reducing operation to decrease pressure in the processing tank, keeping to warm the raw amnionic membrane by irradiating a microwave from a microwave heating device provided outside of the processing tank, pressure-recovering operation to recover the pressure of the processing tank under reduced pressure, and repeating the pressure-reducing or recovering operation in several times. The obtained amnionic membrane itself has the functions of a scaffold and feeder cell, and is useful for producing the cultured multilayered epithelium sheet.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

上皮系細胞を培養により分化・増殖させる場合、対象とする細胞とは異なる種類の支持細胞(フィーダー細胞)を共培養することで、フィーダー細胞が産生する細胞成長因子や細胞外マトリックスを活用する技術が知られており、フィーダー細胞として、マウス由来の3T3線維芽細胞が汎用されている。
培養の対象とする上皮系細胞がヒト細胞である場合、3T3などヒト以外の細胞を対象ヒト細胞の培養液中に存在させない技術、例えば、上皮系細胞を重層化する際、上皮細胞を多孔膜上に置き、支持細胞(フィーダー細胞)を含む培養液を、多孔膜を通して供給し、上皮細胞にフィーダー細胞を接触させずに培養する方法(特許文献1)が提案されている。
一方、MCDB培地にウシ下垂体抽出を添加することで、フィーダー細胞なしに表皮細胞の培養できることが報告されている(非特許文献1)
他方、上皮系細胞をシート状に増殖させるためには、足場となる支持体(スキャホールド)が必要である。羊膜の上皮を脱細胞化したものを、スキャホールドとして利用する技術が知られている。例えば、羊膜上に口腔粘膜上皮細胞を播種し支持細胞の共存下で培養し、口腔粘膜上皮細胞が重層化した後、その最表層を空気に接触させ分化誘導する。次いで羊膜上に口腔粘膜上皮細胞層が形成された角膜上皮様のシートを得る(特許文献2)。(1)乾燥状態である(2)上皮層を有しない(3)使用時にその上で細胞の接着及び増殖が可能な構造を保持した基底膜を有する、角膜上皮様シートの作製方法であって、(a)角膜上皮細胞又は角膜上皮細胞様細胞への分化能を有する細胞を支持細胞の共存下で培養する、(b)前記細胞が増殖して重層化した後、最表層を空気に接触させる工程を含む方法(特許文献3)など。また、プロネクチンFなどの細胞接着シグナルを現す特定のポリペプチドを結合させた羊膜を使用し、無血清培地で培養すれば、角膜上皮細胞を重層化できることが知られている(特許文献4)。

【非特許文献1】
The Journal of Investigative Dermatology, 81, 33s-40s (1983)
【特許文献1】
特開2005-130838
【特許文献2】
WO2003/043542
【特許文献3】
WO2004/078225
【特許文献4】
特開2002-320666

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、培養重層上皮シートの作製方法に関し、特に、特定の乾燥処理により製造される乾燥羊膜を用いた培養重層上皮シートの作製方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
培養重層上皮シートの作製において、(a)無菌状態の乾燥大気中で保存できるように脱水乾燥されており、かつ水又は緩衝液に浸漬して再水和した羊膜には、生羊膜を構成する上皮細胞、基底膜、及び結合組織が保持されている乾燥羊膜を支持体(スキャホールド)として使用し、(b)対象とする口腔上皮細胞を支持細胞(フィーダー細胞)の無い状態で液相化培地で培養し、次いで(c)気相化培養で重層化させることを特徴とする培養重層上皮シートの作製方法。

【請求項2】
 
乾燥羊膜が以下の乾燥処理方法によって製造されるものである請求項1記載の培養重層上皮シートの作製方法
乾燥処理方法:人を含む動物の胎児を包む生羊膜を乾燥処理する際に、該生羊膜を乾燥する乾燥装置として、羊膜を載置した処理槽内を減圧状態とする減圧手段と、減圧状態の前記処理槽内に載置した羊膜を加温する加温手段と、前記処理槽内の減圧状態を大気圧方向に復圧する復圧手段とを具備する乾燥装置を用い、前記減圧手段によって減圧状態の処理槽内に載置した羊膜を、前記加温手段によって加温しつつ、その構成する基底膜及び結合組織が破壊されることのない温度に保持すべく、前記減圧手段によって処理槽内を減圧状態とする減圧操作と、前記復圧手段によって減圧状態の処理槽内を大気圧方向に復圧する復圧操作とを、交互に複数回繰り返して、前記処理槽内に載置した生羊膜を脱水乾燥することを特徴とする羊膜の乾燥処理方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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