Top > Search of Japanese Patents > METHOD FOR ELECTROCHEMICALLY MEASURING PHENYLALANINE OR ALANINE

METHOD FOR ELECTROCHEMICALLY MEASURING PHENYLALANINE OR ALANINE

Patent code P120007397
File No. S2010-1213-N0
Posted date Apr 23, 2012
Application number P2011-066547
Publication number P2012-078338A
Patent number P5892577
Date of filing Mar 24, 2011
Date of publication of application Apr 19, 2012
Date of registration Mar 4, 2016
Priority data
  • P2010-202736 (Sep 10, 2010) JP
Inventor
  • (In Japanese)篠原 寛明
  • (In Japanese)須加 実
  • (In Japanese)三浦 将典
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人富山大学
  • (In Japanese)味の素株式会社
Title METHOD FOR ELECTROCHEMICALLY MEASURING PHENYLALANINE OR ALANINE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for effectively removing an interfering substance in measuring an extremely low density Phe in blood by a sensor; and to provide a method for measuring the Phe density in the blood with high precision.
SOLUTION: This method for measuring a phenylalanine or alanine density in blood using a Phe or Ala sensor that includes an electrode system having an action electrode where phenylalanine dehydrogenase or alanine dehydrogenase, and diaphorase are immobilized, and a counter electrode, includes the following (1)-(6) steps: (1) mixing the blood which is a test object with reagent solution including coenzyme and an electronic mediator to prepare measurement solution, (2) supplying the electrode system with the measurement solution, (3) applying a positive potential to the action electrode of the electrode system to oxidize ascorbic acid and the electronic mediator included in the measurement solution, (4) finishing the application of the positive potential and performing a enzyme reaction for a prescribed time, (5) after the lapse of the prescribed time, applying a positive potential to the action electrode of the electrode system to measure a current value, and (6) calculating the phenylalanine or alanine density in the blood which is the test object, based on the measured current value or an integrated value thereof.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


アミノ酸は生体内における重要代謝物質であり、血中の遊離アミノ酸濃度を計測することは、医療分野における疾患の診断や病状の判定に非常に有用である。特にフェニルアラニン(Phe)は必須アミノ酸の1つであり、重要な代謝物質であるだけではなく、先天性代謝異常症の代表であるフェニルケトン尿症のバイオマーカーとしても注目される。通常、人の血中Phe濃度は60μM程度であるが、重篤なフェニルケトン尿症患者の場合、血中Phe濃度は1 mM以上にまで上昇する。現在、フェニルケトン尿症は高速液体クロマトグラフィー分析、あるいはPhe選択性の高い酵素を用いる分光法を用いる新生児マススクリーンによって検査されている。浅野らが開発したBacillus badius由来のフェニルアラニン脱水素酵素(PheDH)がこの酵素法で活躍している(非特許文献1、2)。



【化1】




ところで、フェニルケトン尿症患者が在宅での食餌療法などのために血中Pheの簡易測定を行うには、上記高速液体クロマトグラフィー分析や分光法の利用は難しく、それに代わる方法として、電気化学センサ(以下、単にセンサと呼ぶことがある)が適している。フェニルアラニンセンサ(以下、Pheセンサと呼ぶことがある)としては、例えば、特許文献1に記載のものがある。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、フェニルアラニンまたはアラニンの電気化学的測定方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
フェニルアラニン脱水素酵素またはアラニン脱水素酵素とジアホラーゼとを金電極の表面に固定化した作用極及び対極を有し、作用極面と対極面とが対向する電極系を含むフェニルアラニンまたはアラニンセンサを用いて血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を測定する方法であって、
(1)被検体である血液を補酵素及び電子メディエーターを含有する試薬液と混合して測定液を調製し、
(2)前記測定液を前記電極系に供給し、
(3)前記電極系の作用極に、対極に対するプラス電位を印加して、前記測定液に含有されるアスコルビン酸及び電子メディエーターの全量を酸化し、
(4)プラス電位の印加を終了し、酵素反応を所定時間実施し、
(5)所定時間経過後、前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、電流値を測定し、
(6)測定した電流値またはその積分値に基づいて前記被検体である血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を算出する、但し、測定した電流値は、プラス電位印加開始後0.1~60秒の範囲のいずれかの時間に計測される電流値であり、電流値の積分値は、プラス電位印加開始後、60秒間に計測された全てまたは一部の電流値から求めた電気量である、
ことを含む前記測定方法。

【請求項2】
 
工程(3)におけるプラス電位は、0.3~0.5Vである、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
酵素反応のための所定時間は、10~60秒間である、請求項1~2のいずれかに記載の方法。

【請求項4】
 
工程(6)におけるフェニルアラニンまたはアラニン濃度の算出は、プラス電位印加開始後0.1~60秒の範囲のいずれかの時間に計測される電流値に基づき、かつ予め作成した検量線を基準にして行う、請求項1に記載の方法。

【請求項5】
 
工程(6)におけるフェニルアラニンまたはアラニン濃度の算出は、プラス電位印加開始後、60秒間に計測された全てまたは一部の電流値から求めた電気量に基づき、かつ予め作成した検量線を基準にして行う、請求項1に記載の方法。

【請求項6】
 
被検体である血液の量は0.2~4μLの範囲であり、試薬液の量は0.3~12μLの範囲である請求項1~5のいずれかに記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
State of application right Registered
Please contact us by E-mail or facsimile if you have any interests on this patent.


PAGE TOP

close
close
close
close
close
close
close