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MICROARRAY FOR DETECTING NEW GENE, METHOD FOR DESIGNING THE SAME, AND APPLICATION THEREOF meetings

Patent code P120007730
File No. S2011-0132
Posted date Jun 27, 2012
Application number P2010-265734
Publication number P2012-115169A
Patent number P5733742
Date of filing Nov 29, 2010
Date of publication of application Jun 21, 2012
Date of registration Apr 24, 2015
Inventor
  • (In Japanese)小倉 淳
  • (In Japanese)瀬々 潤
  • (In Japanese)吉田 真明
  • (In Japanese)福崎 睦美
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人お茶の水女子大学
  • (In Japanese)学校法人関西文理総合学園
Title MICROARRAY FOR DETECTING NEW GENE, METHOD FOR DESIGNING THE SAME, AND APPLICATION THEREOF meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for designing polynucleotide probes for a microarray for use in screening or expression analysis of a homologous gene of an organism with unknown genome, to provide the microarray having the two or more kinds of polynucleotide probes designed by the method for designing, and to provide a method for using the microarray.
SOLUTION: There is provided an algorithm suitable for polynucleotide probes for microarray used for screening or expression analysis of the homologous gene of the organism with the unknown genome. The algorithm originally developed by the inventors etc., is adopted.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年、次世代シーケンサーや次世代マイクロアレイが開発されたことにより、これらを利用して、主要な生物のゲノムデータ(生物の持つ総遺伝子情報)や、トランスクリプトームデータ(生物の様々な条件における遺伝子発現データ)が大量に取得されている。これらのデータにより、主にモデル生物(例えば、ヒト、マウス、ラット、チンパンジー、ゴリラ、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ゾウ、ニワトリ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカ、トラフグ、ホヤ、ヤツメウナギ、線虫、ウニ、プラナリア、シロイヌナズナ、イネ、コムギ、タバコ、ショウジョウバエ、カイコ、ミツバチ、大腸菌、枯草菌、藍藻など)と呼ばれる生物や、その近縁種においては、詳細な遺伝子解析が着々と進められている。しかし、モデル生物から進化的に離れているモデル生物(非モデル生物)においては、ゲノムデータやトランスクリプトームデータがほとんど取得されていないため、モデル生物と同様の詳細なレベルでの遺伝子解析は困難であり、遺伝子解析も非常に遅れている。

しかし、地球上に生息するとされる全生物の種類が数百万~1億種類であることからすれば、動物で約30~40種類、植物で約10~12種類、微生物で約20~30種類程度とされているモデル生物の種類はほんの僅かに過ぎない。そして、このモデル生物以外の非モデル生物の中でも、特に、熱帯雨林、海洋、土壌、極地に生息する生物、あるいは、特殊な進化過程をへてきた生物などには、未知の有用遺伝子資源が無数に存在するといわれている。しかし、モデル生物をターゲットとしたマイクロアレイ等の従来の手段では、非モデル生物の遺伝子の探索や発現解析を効率よく行うことが困難であった。

DNAマイクロアレイ技術とは、20~60ヌクレオチド長のDNAプローブを、物理的あるいは生化学的にスライドガラス上に固定化したマイクロアレイに対して、蛍光標識したDNA又はRNAサンプルを接触させ、DNAプローブとサンプル間のハイブリダイゼーション反応を利用して、特定の遺伝子の発現を検出及び定量する技術である。この技術を利用することで、最大数百万種類の遺伝子の検出及び定量を一度に行うことができる。そして、このような極めて多数の遺伝子の検出と定量を精度良く行うために、マイクロアレイのプローブは、通常、対象とするサンプルの生物種に特化して、特定の遺伝子に対する特異性が非常に高くなるように設計されている。したがって、ある種類の生物用のマイクロアレイを、他の種類の生物のサンプルに用いることはできない。ただし、例外として、ある種類の生物用のマイクロアレイを、その生物に非常に近縁な生物種に対して利用可能な場合もある。例えば、「キイロショウジョウバエ」用のマイクロアレイを、その近縁種である「オナジキイロショウジョウバエ」に用いることは可能であることが知られている(非特許文献1)。様々な生物間の推定分岐年代を記載した“TIME TREE”というウェブサイト上のデータベース(http://www.timetree.org/about.php)によれば、この「キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)」と、「オナジキイロショウジョウバエ(Drosophila simulans)」は、推定分岐年代で約280万年~450万年程度(http://www.timetree.org/time_query.php?taxon_a=7227&taxon_b=7240)しか離れていないほど近縁な生物である。

また、この他に、多種生物種間でマイクロアレイ解析を行う技術として、異種間ハイブリダイゼーション(Cross-species hybridization)という手法が知られている(非特許文献2~5)。しかしながら、この異種間ハイブリダイゼーションは、各生物種に特化したプローブを生物種ごとにそれぞれ同じマイクロアレイに配置したものを用いることで、多種生物間の発現比較を行う技術である。具体的には、ヒト、チンパンジー、オランウータンから同一祖先遺伝子由来の現存する遺伝子を1つずつ選択し、そのヒト遺伝子に特異的なプローブ、チンパンジー遺伝子に特異的なプローブ及びオランウータン遺伝子に特異的なプローブをそれぞれ配置したマイクロアレイを用いることによって、ヒト、チンパンジー、オランウータンの3種におけるそれらの遺伝子発現の違いを観察することが可能となる。しかし、このように、異種間ハイブリダイゼーションは、ある種類の生物用のプローブを異種のサンプルに適用する技術ではないし、ましてや、異種のサンプルからの新規な相同遺伝子のスクリーニングや、その異種のサンプル中のその相同遺伝子の発現解析に適用する技術でもない。すなわち、異種間ハイブリダイゼーションにおいても、マイクロアレイに用いるプローブは、特定の1種の生物の特定の遺伝子に特異的に設計されているため、かかるマイクロアレイを用いて、異種の新規相同遺伝子をスクリーニングしたり、その異種のサンプル中のその相同遺伝子の発現解析を行うことは不可能である。

また、新規な遺伝子を探索する一般的な方法として、既知の類似遺伝子の配列に基づいて設計したプライマーを用いてPCR増幅を試みる方法がある。しかし、この方法では、一度に1~数百種類程度の遺伝子しか探索することができず、また、探索対象の遺伝子の配列とほぼ100%一致するプライマーを設計できた場合にしか、その遺伝子配列を増幅することができない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、特定のマイクロアレイ用のポリヌクレオチドプローブを設計する方法や、かかる設計方法により設計されたポリヌクレオチドプローブを2種類以上備えたマイクロアレイや、かかるマイクロアレイを使用する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
マイクロアレイ用のポリヌクレオチドプローブ配列を設計する方法であって、以下の工程(a)~(h)を含み、前記ポリヌクレオチドプローブ配列が30~60ヌクレオチド長であり、かつ、前記マイクロアレイが、ゲノム未知生物の相同遺伝子のスクリーニング又は発現解析に用いるためのマイクロアレイであることを特徴とする方法;
(a)少なくとも2種類のゲノム既知生物におけるオーソロガス遺伝子のセットを2セット以上同定する工程;
(b)同定したセットのうち、1つのセット中のオーソロガス遺伝子について、ヌクレオチド配列同一性に基づいたマルチプルアライメント処理を行うことによって、マルチプルアライメント配列を作成する工程;
(c)前記マルチプルアライメント配列から、ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド長のプローブ予備候補マルチプルアラインメント配列を、隣接するプローブ予備候補マルチプルアラインメント配列の末端同士が前記ヌクレオチド長の少なくとも15%以上のヌクレオチド長で重複するように、順に取得する工程;
(d)各プローブ予備候補マルチプルアラインメント配列に含まれるゲノム既知生物間のプローブ予備候補配列のヌクレオチド配列同一性を算出し、該プローブ予備候補マルチプルアラインメント配列において、各ゲノム既知生物のプローブ予備候補配列間で、配列が同一でない部位のうち、95%以上に相当する部位が、該プローブ予備候補マルチプルアラインメント配列の3’末端側から33%以内に相当する領域に位置するという条件を充足するかどうかを、ヌクレオチド配列同一性が高いプローブ予備候補マルチプルアラインメント配列から順に確認し、前記条件を初めて充足するプローブ予備候補マルチプルアラインメント配列を、第1プローブ候補マルチプルアラインメント配列として選択し、前記第1プローブ候補マルチプルアラインメント配列に含まれるいずれかのゲノム既知生物のプローブ予備候補配列を第1プローブ候補配列とする工程;
(e)前記第1プローブ候補配列が、前記工程(a)における少なくとも2種類のゲノム既知生物の前記工程(b)におけるセットのオーソロガス遺伝子以外のいずれの遺伝子のヌクレオチド配列とも、前記第1プローブ候補配列のヌクレオチド長の18%以上に相当するヌクレオチド数のヌクレオチドが異なっているという条件を充足するかどうかを確認し、充足する場合は、前記第1プローブ候補配列又はその相補配列を、前記セットのオーソロガス遺伝子用のポリヌクレオチドプローブ配列として選択する工程;
(f)前記第1プローブ候補配列が、前記工程(e)記載の条件を充足しない場合は、前記工程(d)において、次に前記工程(d)記載の条件を充足するプローブ候補マルチプルアラインメント配列を、次のプローブ候補マルチプルアラインメント配列として選択し、前記の次のプローブ候補マルチプルアラインメント配列に含まれるいずれかのゲノム既知生物の配列を次のプローブ候補配列とし、前記の次のプローブ候補配列が前記工程(e)記載の条件を充足するかどうかを確認し、充足する場合は、前記次のプローブ候補配列又はその相補配列を、前記セットのオーソロガス遺伝子用のポリヌクレオチドプローブ配列として選択する工程;
(g)前記次のプローブ候補配列が、前記工程(e)記載の条件を充足しない場合は、前記工程(e)記載の条件を充足するまで、前記工程(f)を順に繰り返し、前記次のプローブ候補配列又はその相補配列を、前記セットのオーソロガス遺伝子用のポリヌクレオチドプローブ配列として選択する工程;
(h)前記工程(b)から(g)までの工程を、前記工程(a)で同定した他のセットについて行う工程。

【請求項2】
 
ゲノム未知生物と、工程(a)における各ゲノム既知生物との推定分岐年代が、5百万年以上であることを特徴とする請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
ゲノム未知生物と、工程(a)における各ゲノム既知生物との推定分岐年代が、1千万年以上7億年以下であることを特徴とする請求項1に記載の方法。

【請求項4】
 
前記工程(a)における2セット以上のオーソロガス遺伝子が、2000セット以上のオーソロガス遺伝子であることを特徴とする請求項1~3のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
 
請求項1~4のいずれかに記載の方法により設計されたポリヌクレオチドプローブ配列からなるポリヌクレオチドプローブを2種類以上備えたマイクロアレイを、ゲノム未知生物の相同遺伝子のスクリーニング又は発現解析に使用する方法。

【請求項6】
 
少なくとも2種類のゲノム既知生物が、ヒト、マウス及びラットから選択される2種類以上の生物であることを特徴とする請求項1~5のいずれかに記載の方法。

【請求項7】
 
請求項1~4のいずれかに記載の方法により設計されたポリヌクレオチドプローブ配列からなるポリヌクレオチドプローブを2種類以上備えたマイクロアレイ。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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