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MOLECULAR ENGINEERING METHOD FOR IN VITRO EVOLUTION OF MEMBRANE PROTEIN

Patent code P120007838
File No. E102P05
Posted date Aug 2, 2012
Application number P2012-145795
Publication number P2014-007983A
Patent number P6016011
Date of filing Jun 28, 2012
Date of publication of application Jan 20, 2014
Date of registration Oct 7, 2016
Inventor
  • (In Japanese)四方 哲也
  • (In Japanese)松浦 友亮
  • (In Japanese)曽我 遥
  • (In Japanese)渡邉 肇
  • (In Japanese)藤井 聡志
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title MOLECULAR ENGINEERING METHOD FOR IN VITRO EVOLUTION OF MEMBRANE PROTEIN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To improve efficiency in screening/selection of a membrane protein during molecular evolutionary engineering (in an enzyme evolution method, for example).
SOLUTION: There is provided a unilamellar liposome. The unilamellar liposome comprises the following items: (a) DNA comprising a promoter sequence, a translation initiation sequence and a sequence encoding a membrane protein; (b) an RNA polymerase; (c) a ribonucleotide; and (d) cell-free protein synthesis system. In one embodiment, the membrane protein is a transporter and the unilamellar liposome further comprises (e) a factor binding to a ligand transported by the membrane protein.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

酵素を進化工学的に改良する方法として、遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系を封入したリポソームとセルソータを用いた方法が利用されている。この方法では、酵素遺伝子にランダム変異を導入した遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系をリポソームに封入し、内部で酵素を発現させる。そして、セルソータにより、より高機能の酵素を含むリポソームを選択することにより、より高機能の酵素をコードする遺伝子を選択することができる。この選択を繰り返すことによって、酵素をコードする遺伝子を進化させることができる(非特許文献1)。この従来法では、専ら、可溶性タンパク質が対象であった。

膜タンパク質が細胞の機能において多くの重要な役割を担うことは周知である。そのため、膜タンパク質を対象とする、新規の分子進化工学、特に、酵素進化工学が求められている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、インビトロにおける膜タンパク質の分子進化工学に利用するための、新規の一枚膜リポソームの分野に関連する。また、本発明は、一枚膜リポソームを用いた、膜タンパク質を対象とする、新規の分子進化工学、特に、酵素進化工学に関連する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
一枚膜リポソームであって、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;、
(d)無細胞蛋白質合成系;ならびに
(e)該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む、一枚膜リポソーム。

【請求項2】
 
請求項1に記載の一枚膜リポソームであって、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソーム。

【請求項3】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項2に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項4】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項3に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項5】
 
複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該一枚膜リポソームは、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド
(d)無細胞蛋白質合成系;ならびに
(e)該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む、ライブラリー。

【請求項6】
 
請求項5に記載のライブラリーであって、前記一枚膜リポソームが核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームである、ライブラリー。

【請求項7】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項6に記載のライブラリー。

【請求項8】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項7に記載のライブラリー。

【請求項9】
 
一枚膜リポソームであって、以下:
(a)翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むRNA;(d)無細胞蛋白質合成系;ならびに、(e)該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む、一枚膜リポソーム。

【請求項10】
 
請求項9に記載の一枚膜リポソームであって、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソーム。

【請求項11】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項10に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項12】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項11に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項13】
 
複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該一枚膜リポソームは、以下:
(a)翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むRNA;(d)無細胞蛋白質合成系;ならびに(e)該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む、ライブラリー。

【請求項14】
 
請求項13に記載のライブラリーであって、前記一枚膜リポソームが核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームである、ライブラリー。

【請求項15】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項14に記載のライブラリー。

【請求項16】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項15に記載のライブラリー。

【請求項17】
 
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下:
(1)以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;
(d)無細胞蛋白質合成系;ならびに、
(e)該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程;ならびに、
(2)工程(1)で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。

【請求項18】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。

【請求項19】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項18に記載の方法。

【請求項20】
 
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下:
(1)以下:
(a)翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むRNA;
(d)無細胞蛋白質合成系;ならびに、
(e)該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程;ならびに、
(2)工程(1)で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。

【請求項21】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。

【請求項22】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項21に記載の方法。

【請求項23】
 
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下:
(i)請求項58のいずれか一項に記載のライブラリーを提供する工程;
(ii)該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程;
(iii)該一枚膜リポソームに含まれるDNAを増幅する工程;および、
(iv)該増幅したDNAを単離する工程、
を包含する方法。

【請求項24】
 
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下:
(i)請求項1316のいずれか一項に記載のライブラリーを提供する工程;
(ii)該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程;
(iii)該一枚膜リポソームに含まれるRNAに逆転写酵素を作用させて、DNAを生成する工程;
(iv)該生成したDNAを増幅する工程;および、
(v)該増幅したDNAを単離する工程、
を包含する方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) ERATO YOMO Dynamical Micro-scale Reaction Environment AREA
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