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MOLECULAR WEIGHT MARKER AND METHOD FOR PREPARING THE SAME

Patent code P120007858
Posted date Aug 9, 2012
Application number P2009-200164
Publication number P2011-050272A
Patent number P5645155
Date of filing Aug 31, 2009
Date of publication of application Mar 17, 2011
Date of registration Nov 14, 2014
Inventor
  • (In Japanese)新川 武
  • (In Japanese)宮田 健
  • (In Japanese)松▲崎▼ 吾郎
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人琉球大学
Title MOLECULAR WEIGHT MARKER AND METHOD FOR PREPARING THE SAME
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a molecular weight marker that is simply prepared in a short time and at a low cost and a method for preparing the same.
SOLUTION: The molecular weight marker includes a polyprotein in which a plurality of immunoglobulin binding domain molecules of one kind containing an immunoglobulin binding domain are linked through linkers and a decomposition product in which the expression host of the polyprotein cuts the linkers.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

従来のタンパク質の電気泳動には、SDS-PAGEやnative-PAGEなどがある。SDS-PAGEは、タンパク質を変性剤で処理することにより、非天然の状態で分子量に依存した分離を行う方法である。この方法によれば、分子量マーカーは正確な分子移動度を示すことができる。一方、native-PAGEは、タンパク質を変性剤で処理せず、天然の状態で分離を行う方法である。この方法によれば、タンパク質を天然の状態で分離できるが、等電点により移動度が異なるため、正確な分子量に依存した移動度を示すことができないという欠点がある。
また、タンパク質の機能分析の主要な方法にウェスタンブロット法がある。これは、目的タンパク質に特異的な抗体(1次抗体)と1次抗体に対する化学標識がされた抗体(2次抗体)を用いる手法である。しかし、ウェスタンブロット法では分子量マーカーの検出にも各々の多様な抗体が必要であり、有用な分子量マーカーが少ないのが現状である。

下記の特許文献1には、プロテインAのABドメインの遺伝子を1~6個挿入したプラスミドをそれぞれ作製し、それらのプラスミドで形質転換した大腸菌JM109から得られるタンパク質を同量ずつ混合してウェスタンブロット用分子量マーカーを作製することが開示されている。

また、下記の特許文献2には、サルモネラ菌鞭毛線維タンパク質にギ酸を加えて溶解し、BrCN(ブロモシアン)のギ酸の溶液を加えて断片化反応を行い、この断片化反応によって得られた反応混合物から種々の分子量をもつタンパク質を得る分子量マーカー作製方法が開示されている。これは、一つの分子量を有するタンパク質が化学的又は酵素的に断片化されて得られる断片を、異なる分子量を持つマーカータンパク質として利用するものである。これによれば、複数のマーカータンパク質を個別に生成して混合する手間を省略することができ、コスト的にも優位性があるものである。

さらに、下記の特許文献3には、精製したTypeI CATをスルホヒドリル基を有する化合物が存在しない酸化状態で約30日間放置して、TypeI CATの会合体からなる分子量マーカーを作製することが開示されている。これは、同一サブユニットから構成される多量体タンパク質を用いることにより、サブユニット間の等電点を同一にし、天然の状態においても分子量に依存した移動度を示すことができるものである。
【特許文献1】
特開平5-32699
【特許文献2】
特開平2-25745
【特許文献3】
特開平7-53589

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、イムノグロブリン結合ドメインを有するタンパク質を含有する分子量マーカー及びその作製方法に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
分子量マーカーであって、イムノグロブリン結合ドメインを有する一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子がリンカーを介して複数個連結されたポリプロテインと、該ポリプロテインの発現宿主が前記リンカーを切断した分解生成物とを含有し、前記ポリプロテインはそのC末端にCys残基が導入され、該Cys残基同士がジスルフィド結合を介して結合していることを特徴とする分子量マーカー。

【請求項2】
 
請求項1に記載の分子量マーカーであって、前記ポリプロテインは前記一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子が2乃至7個連結していることを特徴とする分子量マーカー。

【請求項3】
 
請求項1又は2のいずれかに記載の分子量マーカーであって、前記イムノグロブリン結合ドメイン分子が、スタフィロコッカス(Staphylococcus)プロテインA由来の抗体結合ドメイン、GroupGストレプトコッカス(Streptococcus)G148のGタンパク質(SpG)由来のB1ドメイン、ファインゴルディア・マグナ(Finegoldia magna)由来のLタンパク質よりなる群から選ばれたものである分子量マーカー。

【請求項4】
 
請求項3に記載の分子量マーカーであって、前記スタフィロコッカス(Staphylococcus)プロテインA由来の抗体結合ドメインが、下記(a)又は(b)のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする分子量マーカー。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列

【請求項5】
 
請求項3に記載の分子量マーカーであって、前記GroupGストレプトコッカス(Streptococcus)G148のGタンパク質(SpG)由来のB1ドメインが、下記(a)又は(b)のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする分子量マーカー。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列

【請求項6】
 
請求項3に記載の分子量マーカーであって、前記ファインゴルディア・マグナ(Finegoldia magna)由来のLタンパク質が、下記(a)又は(b)のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする分子量マーカー。
(a)配列番号3で表されるアミノ酸配列
(b)配列番号3で表されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列

【請求項7】
 
請求項1に記載の分子量マーカーであって、以下の表に記載される分子量の単量体および二量体を有するものである、分子量マーカー。
(式省略)

【請求項8】
 
分子量マーカーを作製する方法であって、
イムノグロブリン結合ドメインを有する一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子リンカーを介して複数個連結されたポリプロテインを作成する工程と、
該ポリプロテインの発現宿主が前記リンカーを切断することにより複数の分子量を有する分子量マーカーを作製する工程と
を有し、前記ポリプロテインはそのC末端にCys残基が導入され、該Cys残基同士がジスルフィド結合を介して結合していることを特徴とする分子量マーカー作製方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2009200164thum.jpg
State of application right Registered
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