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METHOD OF DETECTING PEPTIDE

Patent code P120008046
File No. S2011-0474
Posted date Oct 24, 2012
Application number P2011-187969
Publication number P2012-194170A
Patent number P5817980
Date of filing Aug 30, 2011
Date of publication of application Oct 11, 2012
Date of registration Oct 9, 2015
Priority data
  • P2011-045491 (Mar 2, 2011) JP
Inventor
  • (In Japanese)甲斐 雅亮
  • (In Japanese)椛島 力
  • (In Japanese)柴田 孝之
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人長崎大学
Title METHOD OF DETECTING PEPTIDE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a speedy and simple method of detecting peptide.
SOLUTION: In a method of detecting peptide, peptide is reacted with a compound represented by formula (I) (where R represents halogen atom, carboxy C1-6 alkyl or carboxyl) in a boric acid solution in the presence of an oxidant at 20-50°C, to produce a fluorescent substance.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

ペプチドは、ホルモンやシグナル伝達物質などとして生命現象の中心的な役割を担っているだけでなく、治療薬や疾病のマーカーとしても利用されているなど、非常に重要な生体分子である。ペプチドの検出・定量は一般的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分離と210~300nmのUV波長における吸光度測定を組み合わせて行われる。吸光度による検出は、ペプチドに含まれるペプチド結合と芳香族置換基の量に依存するため感度が低く、ナノモル程度が検出限界である。蛍光法は、吸光度法と比較して感度が高いことから、ペプチドのみを選択的に蛍光誘導体化できれば、微量の生体サンプルからペプチドの検出および定量が容易になる。

従来のペプチドの蛍光検出に対しては、第一アミンと反応して蛍光性を与えるo-フタルアルデヒド試薬やフルオレッサミン試薬、ペプチド鎖中のアルギニンのアミジノ基と反応して蛍光性を与えるベンゾイン試薬、N末端にチロシンを含むペプチドを特異的に蛍光体にするヒドロキシルアミン試薬など、数種のペプチドの蛍光誘導体化試薬が開発されている。しかしこれらの試薬は、生体に大量に存在するアミノ酸をはじめとするペプチド以外の生体成分と反応して蛍光性を与えてしまうため、生体試料中のペプチドに対する選択性が低いという欠点を有する。

一方で本発明者らは、逆相液体クロマトグラフィーとペプチドN末端部位における蛍光体形成反応を利用したペプチド定量方法を開発した(非特許文献1参照)。この反応は、ホウ酸塩緩衝液中でペプチドとカテコールを過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤の存在下で100℃付近の高温で加熱する操作により、ペプチドを蛍光誘導体化するものである。

ところで、コラーゲンは臓器や骨など組織の構造を維持するために重要なタンパク質であり、ヒト生体中に存在する総タンパク質の約30%を占めている。コラーゲン量は老化と密接な関係があることから、生体試料中に含まれるコラーゲンの簡便かつ特異的な検出、またコラーゲン量の簡便かつ特異的な測定の開発は、ヒトの健康状態を検査するためにも重要である。さらに、コラーゲンは被験者から外科的に試料を入手する必要があるが、そのため被験者の負担を最小限に抑えるよう、微量の試料から高感度にコラーゲン量を測定する必要もある。
現在、公知のコラーゲン定量法としてELISA法や比色法、o-フタルアルデヒドを用いた蛍光法等に基づく技術が知られており、その技術に基づくキットが市販されている。しかし、ELISA法は抗原抗体反応に依存するため、高価なキットになっている。また比色法によれば、コラーゲンと色素の相互作用に基づく吸収の変化を測定するために感度が低く、また多くの試料を必要とすること、特異性が低いこと、などの欠点があった。またo-フタルアルデヒドを用いる方法(非特許文献2参照)では、アミノ末端を検出するという特徴から、サンプル中に含まれるコラーゲン(またはコラーゲン由来のペプチド)以外のタンパク質やペプチド、アミノ基を有するペプチド側鎖をも検出してしまい、ブランクが非常に高いという欠点があった。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、ペプチドの検出方法に関する。特に本発明は、コラーゲン由来のペプチドの検出および定量に有用である。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
N末端がグリシンであるペプチドと、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸を、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、20~50℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法。

【請求項2】
 
反応が、pH7~8で行われる、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
 
プチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】
 
試料中のコラーゲンを検出する方法である、請求項4に記載の方法。

【請求項6】
 
試料中のコラーゲンを定量する方法である、請求項4に記載の方法。

【請求項7】
 
3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸、酸化剤およびホウ酸溶液を含んでなる、N末端がグリシンであるペプチド検出試薬。

【請求項8】
 
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項7に記載の試薬。

【請求項9】
 
プチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、請求項7または8に記載の試薬。

【請求項10】
 
コラーゲンの検出試薬である、請求項9に記載の試薬。

【請求項11】
 
N末端がグリシンであるペプチドと、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸を、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、20~50℃で反応させることを特徴とする、ペプチドの蛍光標識方法。

【請求項12】
 
反応が、pH7~8で行われる、請求項11に記載の方法。

【請求項13】
 
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項11または12に記載の方法。

【請求項14】
 
プロリン-グリシンのアミノ酸配列からなるペプチドと、3,4-ジヒドロキシ安息香酸を、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、20~50℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法。

【請求項15】
 
反応が、pH7~8で行われ、酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項14に記載の方法。

【請求項16】
 
3,4-ジヒドロキシ安息香酸、酸化剤およびホウ酸溶液を含んでなる、プロリン-グリシンのアミノ酸配列からなるペプチドの検出試薬。

【請求項17】
 
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項16に記載の試薬。

【請求項18】
 
プロリン-グリシンのアミノ酸配列からなるペプチドと、3,4-ジヒドロキシ安息香酸を、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、20~50℃で反応させることを特徴とする、ペプチドの蛍光標識方法。

【請求項19】
 
反応が、pH7~8で行われ、酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項18に記載の方法。

【請求項20】
 
プロリン-グリシンまたはプロリン-アラニンのアミノ酸配列からなるペプチドと、4-クロロカテコールを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、20~50℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法。

【請求項21】
 
反応が、pH7~8で行われ、酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項20に記載の方法。

【請求項22】
 
4-クロロカテコール、酸化剤およびホウ酸溶液を含んでなる、プロリン-グリシンまたはプロリン-アラニンのアミノ酸配列からなるペプチドの検出試薬。

【請求項23】
 
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項22に記載の試薬。

【請求項24】
 
プロリン-グリシンまたはプロリン-アラニンのアミノ酸配列からなるペプチドと、4-クロロカテコールを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、20~50℃で反応させることを特徴とする、ペプチドの蛍光標識方法。

【請求項25】
 
反応が、pH7~8で行われ、酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項24に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
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