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METHOD FOR INHIBITING AUTOPHAGY USING ATG7 MUTANT

Patent code P130008624
File No. FU510
Posted date Mar 6, 2013
Application number P2012-280082
Publication number P2014-122186A
Patent number P6052540
Date of filing Dec 21, 2012
Date of publication of application Jul 3, 2014
Date of registration Dec 9, 2016
Inventor
  • (In Japanese)青木 耕史
  • (In Japanese)谷田 以誠
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人福井大学
Title METHOD FOR INHIBITING AUTOPHAGY USING ATG7 MUTANT
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a means for specifically and efficiently inhibiting autophagy by targeting ATG7.
SOLUTION: The invention provides: an autophagy inhibitor comprising a dominant negative mutant of ATG7 polypeptide or a nucleic acid comprising a nucleotide sequence coding for the mutant; and a method for inhibiting autophagy comprising introducing the dominant negative mutant of ATG7 polypeptide or the nucleic acid comprising the nucleotide sequence coding for the mutant into isolated cells, thereby inhibiting the activity of wild-type ATG7 polypeptide in the cells, and the like.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

細胞には、細胞内にできた異常な蛋白質、小器官、不溶物質、細胞外からの侵入物(細菌やウイルス)などを分解するシステムとしてオートファジーがあり、哺乳類が生存するために必須の機能を担っている。

これまでに、マウスの遺伝学的解析などから、オートファジーが細胞の生理的機能に重要な役割を果たしていることが分かっている(非特許文献1)。また近年のヒトのゲノムワイドの遺伝学解析や、遺伝子変異マウスを用いた解析から、癌、クローン病(炎症性腸疾患の一つ)、神経変成疾患、心筋症、糖尿病、感染症、腎臓病などとオートファジーとの関連が明らかとなっている(非特許文献2)。クローン病では、オートファジー関連因子ATG16Lやオートファジーの活性を制御するIRGMなどの遺伝子異常が見つかっている(非特許文献3)。そのため、これらの疾患の誘発におけるオートファジーの役割を明らかにすることは、これらの疾患の病因の解明や、治療戦略の提案に必要であると考えられている。

オートファジーでは、脂質二重層からなるオートファゴソームという小器官がリソゾームという小器官と融合したオートファゴリソゾームの中で、標的分子が分解される。オートファゴソームの形成には、二種類の分子結合体が必要であり、一つは、LC3B(ATG8とも呼ばれる)にフォスファチジルエタノールアミン(PE)が結合したLC3B-PE結合体(LC3B-II)、もう一つは、ATG12がATG5と結合したATG12-ATG5結合体である。これらの分子の結合反応の鍵酵素であるE1様酵素がATG7である。

野生型ATG7は、活性中心である572番目(ヒトATG7の場合)のシステイン残基を介して基質であるLC3BやATG12のC末端とチオエステル結合を形成する(図1)。このチオエステル結合は、高エネルギー状態であり、不安定な結合であるため、LC3BやATG12はすみやかにE2様酵素であるATG3やATG10にそれぞれ受け渡され、LC3B-PE結合反応やATG12-ATG5結合反応が起こる。

ATG7:C572S変異体は、前記572番目のアミノ酸残基(システイン残基)がセリン残基に置換された変異型ポリペプチドである。ATG7:C572S変異体は、活性中心のセリン残基を介して基質であるLC3BやATG12とO-エステル結合を形成する。このO-エステル結合は、野生型ATG7で形成されたチオエステル結合に比べて結合状態が安定なため、LC3BやATG12は、野生型ATG7の場合ほど容易には解離しないことが報告されている(非特許文献4)。しかしながら、細胞内でのATG7:C572S変異体の発現がオートファゴソーム形成にどのような影響を及ぼすかについては知られていない。

従来より、オートファジーの抑制方法として、薬剤を用いる方法、ATG4B、ATG5などの変異体を用いる遺伝子工学的方法などが知られている(非特許文献5)。例えば、ATG4BC74A変異体(ATG4Bのプロテアーゼ活性を欠損させた変異型ポリペプチド)は、LC3B-PE結合体(LC3B-II)から、LC3Bの乖離・再利用を阻害することで、オートファジーを抑制することが知られている(非特許文献6)。即ち、ATG4BC74A変異体は、オートファゴソーム形成に必要な二つの経路であるLC3B-PE結合体の形成とATG12-ATG5結合体の形成のうち、LC3B-PE結合体の形成のみを抑制することでオートファジーを抑制する。また、ATG5K130R変異体は、上記二つの経路のうち、一次的にはATG12-ATG5結合体の形成を抑制するが、ATG12はLC3B-PE結合体の形成にも関与しているため、間接的にLC3B-PE結合体の形成も抑制し、オートファジーを抑制する(非特許文献7)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、ATG7変異体を用いたオートファジー抑制剤及びオートファジーの抑制方法などに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ATG7ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体又は当該変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有してなる、オートファジー抑制剤であって、ここで、ATG7ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体が、野生型ATG7ポリペプチドの天然の基質とO-エステル結合を形成するように、野生型ATG7ポリペプチドにおける活性中心であるシステイン残基がセリン残基に置換された変異体である、オートファジー抑制剤

【請求項2】
 
野生型ATG7ポリペプチドが、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する、請求項1記載の剤。

【請求項3】
 
ATG7ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体又は当該変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を単離された細胞内に導入することにより、当該細胞内の野生型ATG7ポリペプチドの活性を阻害することを含む、オートファジーの抑制方法であって、ここで、ATG7ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体が、野生型ATG7ポリペプチドの天然の基質とO-エステル結合を形成するように、野生型ATG7ポリペプチドにおける活性中心であるシステイン残基がセリン残基に置換された変異体である、オートファジーの抑制方法

【請求項4】
 
野生型ATG7ポリペプチドが、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する、請求項3記載の方法。

【請求項5】
 
細胞が哺乳動物細胞である、請求項3又は4に記載の方法。

【請求項6】
 
ATG7ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体又は当該変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有してなる、オートファジーを利用する病原菌による感染症の予防又は治療剤であって、ここで、ATG7ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体が、野生型ATG7ポリペプチドの天然の基質とO-エステル結合を形成するように、野生型ATG7ポリペプチドにおける活性中心であるシステイン残基がセリン残基に置換された変異体である、オートファジーを利用する病原菌による感染症の予防又は治療剤
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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