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(In Japanese)ガンのリンパ節転移またはそのリスクを判定する方法及びそのための迅速判定キット meetings foreign

Patent code P130009035
File No. H2104091
Posted date Apr 15, 2013
Application number P2010-540345
Patent number P4756288
Date of filing May 27, 2010
Date of registration Jun 10, 2011
International application number JP2010059049
International publication number WO2010137671
Date of international filing May 27, 2010
Date of international publication Dec 2, 2010
Priority data
  • P2009-128323 (May 27, 2009) JP
Inventor
  • (In Japanese)本山 悟
  • (In Japanese)三浦 昌朋
  • (In Japanese)小川 純一
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人秋田大学
  • (In Japanese)アークレイ株式会社
Title (In Japanese)ガンのリンパ節転移またはそのリスクを判定する方法及びそのための迅速判定キット meetings foreign
Abstract (In Japanese)本発明は、ガンのリンパ節転移またはそのリスクを迅速かつ確実に判定する方法及び手段の提供を目的とする。具体的にはヒトC反応性タンパク質遺伝子の特定の遺伝子多型を同定することにより、ガンのリンパ節転移またはそのリスクを判定する方法及び迅速判定キットを提供するものであり、ガンの進展において重要な事象であるリンパ節転移を有効に予測・判定できるため、治療戦略を決定する上での臨床的意味は極めて大きい。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

ガン細胞は、原発巣を離れ、血管やリンパ管を経由して全身に転移する。ガンの手術では、できるだけ確実に病巣を取り除くことが必要であるため、転移を正確に検出し、転移の度合いに応じて適切な治療をすることが要求される。このため、ガン細胞のリンパ節転移の診断は適切な治療の選択に極めて重要な意義を有している。

ガン細胞のリンパ節転移の診断は、治療前に行う画像診断と治療(手術)後に行う病理学的診断に大別することができる。画像診断としては、CT(computed tomography:コンピュータ断層撮影)、PET(positron emission tomography:ポジトロン放出断層撮影法)ないしPETとCTを一体化した装置によるPET-CT、EUS(endoscopic ultrasoundscopy:超音波内視鏡検査)などを使用する方法があり、ガンのリンパ節転移の検出(リンパ節転移の有無等の検査)に使用されているが、これらの画像診断では、微小なリンパ節転移の検出は困難であるか限定的にしか有効でない。一方、病理学的診断は、摘出された数多くのリンパ節組織より作成された標本を顕微鏡下で観察する方法であり、精度が高い確実な診断法であるが、摘出したリンパ節を使用してしか診断ができず、治療(手術)後の診断となるため、予め最適な治療を選択するためには使用できない。このように、治療前診断は画像診断に頼らざるを得ないが、現状では精度が低く、その一方、確実な診断は病理学的診断によりなされるがこれは治療(手術)後の診断である、という課題がガン細胞のリンパ節転移の診断にはあった。

このため、ガン細胞のリンパ節転移診断では分子マーカーを用いた分子診断的手法が重要であり、幾つかの手法が公知である。従来公知のそうした分子診断的手法の多くは、正常細胞には発現しないか若しくは発現量が低く、ガン細胞には多く発現するタンパク質(標的タンパク質)または該標的タンパク質をコードする遺伝子に含まれる核酸(標的核酸:DNA、mRNA、cDNAなどの総称として)を分子マーカーとして検出する方法である。具体的には、生体から切除・摘出したリンパ節組織に含まれる標的タンパク質をイムノアッセイにより検出したり、標的核酸を、LAMP法(loop-mediated isothermal amplification method)やPCR(polymerase chain reaction)法などを用いて増幅し、該増幅産物を公知の方法により検出することでガン細胞の転移の診断(判定)を行っている。

分子診断的手法として、たとえば、特許文献1(特開2007-175021)は、PIGR、CLDN3、LGALS4、AGR2、TACSTD1、GPX2、RAI3、TSPAN1、CKB、ELF3、FXYD3、CDH1、REG4、GDF 15、CLDN4、OLFM 4、CD9、CDH17、SELENBP、LCN2、TMPRSS4、CFTR、TM4SF3、ID1、CYP2S1、TFF3、EHF、FAT、KLF5、SLC9A3R2、HOXB9、ATP1B1、PCK1、FCGBPからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子のmRNAまたはその断片を含む、大腸ガンに由来のガン細胞のリンパ節転移の有無を判定するために用いられるリンパ節転移マーカーを提案しており、特許文献2(特開2007-037421)は、NM_003404(G1592)、NM_002128(G2645)、NM_052868(G3031)、NM_005034(G3177)、NM_001540(G3753)、NM_005722(G3826)、及びNM_015315(G4370)のデータベースのアクセス番号(シリアル番号)で表される遺伝子セットの発現量を特定の判別式に代入して大腸ガンのリンパ節転移を判定するものである。また、特許文献3(特開2008-020438)は、リンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチンに関連するポリペプチドを定量することで高い信頼性で乳ガンなどのリンパ節転移を判定できるとしている。

一方、最近、炎症反応がDNAを損傷し、血管新生や細胞増殖を刺激し、アポトーシスを阻害するなどしてガンの発生を促進することが知られてきている。これと関連して、血清中のCRP(C-reactive protein:C反応性タンパク質)が、大腸ガン(非特許文献1:Erlinger T.P. et al., JAMA 2004;291;585-590)、食道ガン(非特許文献2:Shimada H. et al., J. Surg. Oncol. 2003;83;248-252)、肝細胞ガン(非特許文献3:Hashimoto K. et al., Cancer 2005;103;1856-1864)、腎臓ガン(非特許文献4:Miyata Y. et al., Urology 2001;58;161-164)及び卵巣ガン(非特許文献5:Hefler L.A. et al., Clin. Cancer Res. 2008;14;710-714)の危険因子及び予後因子として検討されている。

また、血清中の高CRP濃度は高いガンの罹患リスクと関係するとされている。たとえば、非特許文献6(Nozoe T. et al., Am. J. Surg. 1998;176(4):335-8)には、大腸ガン患者について肝転移やリンパ節転移が血清中CRP値の術前での上昇と関係していることが記載され、非特許文献7(Nozoe T. et al., Am. J. Surg. 2001; 182(2), 197-201)には食道ガン患者について、リンパ節転移が血清中CRP値の術前での上昇と関係していることが記載されており、また、非特許文献8(Ines G. et al., World J. Gastroenterol. 2006;12(23), 3746-3750)には食道ガン患者の血清中CRP値の高値とリンパ節転移が関係していることが記載されている。

一方で、その遺伝子多型が血清中のCRP濃度と強く関連しているとの報告もなされている(非特許文献9:Carlson C.S. et al., Am. J. Hum. Gen. 2005; 77;64-77、非特許文献10:Szalai A.J. et al., J. Mol. Med. 2005;83;440-447)。

上記の状況の下、本発明者らは、食道ガン患者のCRP遺伝子多型がガン進展因子となるかどうかを検討した。その結果、CRP-717T>C遺伝子多型がリンパ節転移と関係する可能性を指摘したが(非特許文献11:本山他、「日本消化器外科学会雑誌」第41巻第7号1169頁、2008年7月)、CRP-717T>C遺伝子多型によるガン細胞のリンパ節転移の判定手法は判定精度が低く、有意差をもって転移が判定できず実用に至るものではなかった。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、ガンのリンパ節転移を判定する方法及びそれに用いる迅速判定キットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
配列表の配列番号4に示される塩基配列で表されるヒトC反応性タンパク質遺伝子の部分配列の第422番目の塩基の遺伝子多型を同定することにより、ガンのリンパ節転移またはそのリスクを判定する方法。

【請求項2】
 
該遺伝子多型がT/Tタイプであるときに高リスクと判定する請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
該遺伝子多型の同定をRFLPまたは対応する相補鎖配列との結合により行なう請求項1~2のいずれかに記載の方法。

【請求項4】
 
該遺伝子多型の同定をPCR-RFLPにより行なう請求項3に記載の方法。

【請求項5】
 
PCRにおけるプライマーとして Forwardプライマー:5'-CTT ATA GAC CTG GGC AGT-3'(配列番号1)、Reverseプライマー:5'-GGA GTG AGA CAT CTT CTT G-3' (配列番号2)を用い、制限酵素としてBst4CIを用いる請求項4に記載の方法。

【請求項6】
 
ガンが固形ガンである請求項1~5のいずれかに記載の方法。

【請求項7】
 
配列表の配列番号4に示される塩基配列で表されるヒトC反応性タンパク質遺伝子の部分配列の第422番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーとRFLPにより該第422番目の塩基における遺伝子多型を判定するための制限酵素を含むガンのリンパ節転移またはそのリスクを判定するためのPCR-RFLP用迅速判定キット。

【請求項8】
 
プライマー対としてForwardプライマー:5'-CTT ATA GAC CTG GGC AGT-3' (配列番号1)、Reverseプライマー:5'-GGA GTG AGA CAT CTT CTT G-3' (配列番号2)を含む請求項7に記載の迅速判定キット。

【請求項9】
 
制限酵素Bst4CIを含む請求項8に記載の迅速判定キット。

【請求項10】
 
配列表の配列番号4に示される塩基配列で表されるヒトC反応性タンパク質遺伝子の部分配列の第422番目の塩基又はこれに対応する相補鎖の塩基を含み、かつ配列番号1及び配列番号2のプライマーを用いたPCR法によって増幅され得る領域に由来するDNA断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸を、当該DNA断片に対して特異的にハイブリダイズさせる工程を含む、請求項1に記載の方法。

【請求項11】
 
ヒトC反応性タンパク質遺伝子の遺伝子多型を同定する際に使用する試料が、全血、白血球、ガン原発巣、リンパ管、リンパ節組織からなる群より選ばれる、請求項1~6のいずれかに記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
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