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ANTIMOUSE TRAIL MONOCLONAL ANTIBODY achieved

Patent code P010000439
File No. A031P47
Posted date Jan 17, 2003
Application number P1999-217763
Publication number P2001-037496A
Patent number P3585399
Date of filing Jul 30, 1999
Date of publication of application Feb 13, 2001
Date of registration Aug 13, 2004
Inventor
  • (In Japanese)奥村 康
  • (In Japanese)八木田 秀雄
  • (In Japanese)榧垣 伸彦
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title ANTIMOUSE TRAIL MONOCLONAL ANTIBODY achieved
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an antimouse TRAIL monoclonal antibody that can simply and exactly analyze in vitro or in vivo physiological functions other than the TRAIL development induction mechanism and the target cell breaking mechanism.
SOLUTION: Mouse B lymphoma 2PK-3 cell is prepared by transfecting the cell with the cDNA of mouse TRAIL, and the rat spleen cell immunized with the 2PK-3 cell and mouse myeloma cell are cell-fused to prepare a hybridoma. The hybridoma is cultured to produce the objective antimouse TRAIL monoclonal antibody that specifically binds to the mouse-originating TRAIL without cross reaction with Fas or TNF and completely inhibits the cytotoxic activity of TRAIL.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor:以下「TNF」という)は、ある種の癌細胞にアポトーシス(細胞死)を誘導するサイトカインの一種であり、疎水性ペプチドをN末端側に有するII型細胞膜貫通蛋白質として知られている。また、TNFとよく似た構造を有する細胞膜貫通蛋白質として、Fas抗原のリガンド、B細胞表層抗原CD40のリガンド、T細胞表層抗原CD27やCD30のリガンドなどが存在し、これらはTNFファミリーと呼ばれ、かかるTNFファミリーに属する分子の受容体群はTNF受容体ファミリーと呼ばれている。



TNFファミリーの一員である腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TNF-related apoptosis-inducing ligand:以下「TRAIL」という)は、TNFファミリー間における相同性に基づくデータベース検索によって、30kDaのII型細胞表面蛋白としてクローニングされ、またTRAILの細胞外領域は、TNFファミリー間においては、アポトーシス誘導分子の1つであるFasリガンド(以下「FasL」という)に対して最も高い相同性を示し(アミノ酸レベルで28%)、さらに、FasL同様、さまざまな腫瘍細胞にアポトーシスを誘導することが報告されている。



またこれまでに、TRAILに対応するレセプターとして、少なくとも4分子、すなわちTRAILレセプター1(DR4ともいう)、TRAILレセプター2(DR5、TRICK2あるいはkillerともいう)、TRAILレセプター3(TRID、DcR1あるいはLITともいう)及びTRAILレセプター4(TRUNDDあるいはDcR2ともいう)が存在し、これらレセプターは、TRAILに対してほぼ同程度の親和性を示すが、その機能や存在様式については異なることが明らかとなっている。例えば、TRAILレセプター1及びTRAILレセプター2は細胞内領域にデスドメインと呼ばれるアポトーシスの誘導に必要とされる部位を有し、三量体TRAILとこれらレセプター分子が結合すると、FasLのレセプターであるFasと同様に、カスパーゼと呼ばれる一連の蛋白質分解酵素群を介して細胞にアポトーシスを誘導する。



一方、TRAILレセプター3は細胞内領域を完全に欠いており、細胞膜上の糖脂質(グリコホスファチジルイノシトール:GPI)に結合することにより細胞表面上に存在すると考えられている。このTRAILレセプター3は、細胞内にアポトーシスシグナルを誘導することはできないが、TRAILレセプター1やTRAILレセプター2とTRAILへの結合をめぐって拮抗的に作用することから、TRAILの機能を抑制するものと考えられている。また、TRAILはFasLとは異なり、腫瘍細胞のみに選択的にアポトーシスを誘導し、正常細胞に対しては無力であることが知られているが、TRAILレセプター3のメッセンジャーRNAの発現が正常細胞のみにおいて検出され、腫瘍細胞では認められないことから、正常細胞のTRAILに対する耐性の獲得にTRAILレセプター3が関与する可能性が示唆されている。



第4のレセプター分子であるTRAILレセプター4は、TRAILレセプター1やTRAILレセプター2と同様、I型膜構造形態をとるもののデスドメインの大半を失っており、アポトーシスの誘導は不可能とされている。しかしながら、TRAILレセプター4はNF-κBを介したアポトーシス抑制性のシグナルを誘導することが可能であることから、TRAILレセプター1及びTRAILレセプター2からのアポトーシスシグナルに対して抑制的にはたらくものと考えられている。TRAILのアポトーシス誘導作用に対する細胞側の感受性は、アポトーシスを誘導するレセプター(TRAILレセプター1及びTRAILレセプター2)の発現とアポトーシスに対して抑制的にはたらくレセプター(TRAILレセプター3及びTRAILレセプター4)の発現との絶対的及び相対的な差によって一義的に決定されると考えられている。しかしながら、細胞側のTRAILに対する耐性獲得の要因としてレセプターの発現以外にもFADD様インターロイキン1β変換酵素抑制蛋白質(FLIP:Fas-associated death domain-like IL-1β-converting enzyme-inhibitory protein)等の細胞内でアポトーシスシグナルを抑制する分子の存在が関与する可能性も報告されており、これら細胞内外のさまざまな要因によりTRAILに対する感受性が決まると推測されている。



RNAレベルでのTRAIL及びTRAILレセプター1~4の発現は多くの組織や細胞で認められるが、これら分子の蛋白質レベルでの発現や生理的機能についてはいまだ不明な点が多い。最近、本発明者らは、ヒトCD4T細胞クローンが恒常的にTRAILを表出し、ヒト由来T細胞リンパ種Jurkatや不死化した角化細胞であるHaCaTといった標的細胞をTRAILを介して破壊することを見い出した。また、トーマスらも同様にメラノーマに対するCD4T細胞クローンがTRAILを介して標的細胞を破壊することを報告している。



上記のように、TRAILとほかの標的細胞破壊機構がどのように使い分けられているかは、未だ不明な点が多く、また、TRAIL発現が誘導するメカニズムは、まだ明らかとなっていない。さらに、最近、HIVに感染するとT細胞がTRAILに対して感受性を示すようになり、アポトーシスが誘導されやすくなることや、HIV感染患者由来末梢血T細胞の抗CD3抗体刺激によるアポトーシス(activation-induced cell death)にTRAILが関与することから、HIV感染細胞の排除やAIDS発症児におけるリンパ球減少などの病態形成にTRAILが関与する可能性が示唆されているものの、そのメカニズムの詳細は明らかになっていない。以上のことから、これらTRAILの発現誘導機構や標的細胞破壊機構以外のほかの生理的機能について、そのメカニズム解析に有用な試薬の存在が期待されていた。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、マウス等非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに特異的に結合する抗TRAILモノクローナル抗体、その製造方法及びかかるモノクローナル抗体を有効成分として含有するTRAIL機能解析用試薬に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、非ヒト動物由来のFasリガンドや非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せず、かつ、該非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害するモノクローナル抗体の製造方法であって、非ヒト動物由来TRAILのcDNAを該非ヒト動物と同種の株化細胞にトランスフェクションして形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞で免疫した異種の非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と同種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養することを特徴とする抗非ヒト動物TRAILモノクローナル抗体の製造方法。

【請求項2】
 
非ヒト動物が齧歯類動物であることを特徴とする請求項1記載の抗非ヒト動物TRAILモノクローナル抗体の製造方法。

【請求項3】
 
齧歯類動物として、マウスとラットを用いることを特徴とする請求項2記載の抗非ヒト動物TRAILモノクローナル抗体の製造方法。

【請求項4】
 
株化細胞が、マウスBリンパ腫2PK-3細胞であることを特徴とする請求項1~3のいずれか記載の抗非ヒト動物TRAILモノクローナル抗体の製造方法。

【請求項5】
 
マウス由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、マウス由来のFasリガンドやマウス由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せず、かつ、該マウス由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害することを特徴とする抗マウスTRAILモノクローナル抗体。

【請求項6】
 
請求項5記載の抗マウスTRAILモノクローナル抗体を有効成分として含有することを特徴とするTRAIL機能解析用試薬。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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12821_01SUM.gif
State of application right Registered
License status (In Japanese)通常実施権[C04-02]
Reference ( R and D project ) CREST Host Defense Mechanism AREA
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