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METHOD FOR INCREASING EFFICIENCY OF AMPLIFYING GENE, AND KIT FOR IMPLEMENTING THE SAME

Patent code P130009369
File No. 05143(B)
Posted date Jun 14, 2013
Application number P2011-203822
Publication number P2012-034698A
Patent number P5464378
Date of filing Sep 16, 2011
Date of publication of application Feb 23, 2012
Date of registration Jan 31, 2014
Inventor
  • (In Japanese)清水 典明
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人広島大学
Title METHOD FOR INCREASING EFFICIENCY OF AMPLIFYING GENE, AND KIT FOR IMPLEMENTING THE SAME
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for increasing the efficiency of amplifying genes in amplifying desired genes in mammal cells, and a kit for implementing the method.
SOLUTION: When a replication origin functioning within an eukaryote cell, a nuclear matrix coupling zone, and a desired gene are introduced into a mammal cell, an inverted repeat sequence (palindrome, etc.) is introduced. The replication origin derives from the replication origin of a c-myc gene locus, a dihydrofolate reductase gene locus, or a β-globin gene locus, and the nuclear matrix coupling zone derives from an Igκ gene locus, an SV40 initial region, or the nuclear matrix coupling zone of a dihydrofolate reductase gene locus.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

本発明者は、哺乳動物複製開始領域(IR; initiation region)と核マトリックス結合領域(MAR; matrix attachment region)とを持つプラスミド(以下「IR/MAR プラスミド」という)をヒト由来がん細胞(COLO 320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株)にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子(ブラスティサイジン(Blasticidine)あるいはネオマイシン(Neomycine))を利用して選択するだけで、

(1)発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子(以下、適宜「目的遺伝子」という)の細胞内コピー数を1万コピー程度にまで増幅できること、および、

(2)目的遺伝子はIR/MAR プラスミドに対して同一の遺伝子構築物(シス)として導入した場合であっても、別の遺伝子構築物(トランス)として導入した場合であっても、高度に増幅することができるということを発見した(特許文献1および非特許文献1参照)。そして、本発明者は当該知見に基づいて、IR/MAR プラスミドと目的遺伝子とを、哺乳動物細胞(例えば、ヒト由来がん細胞(COLO 320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株)、CHO細胞等)にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子(BlasticidineあるいはNeomycine )を利用して選択するだけで、目的遺伝子を1万コピー程度に増幅できる系(以下、「高度遺伝子増幅系」という)を完成させるに至った。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、哺乳動物細胞において所望の遺伝子を増幅する際に、遺伝子増幅効率を増加させる方法、および当該方法を行なうためのキットを提供する。より好ましくは本発明は、本発明者が開発した「高度遺伝子増幅系」を用いて所望の遺伝子を増幅する際の遺伝子増幅効率をさらに増加させる方法、および当該方法を行なうためのキットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
(i)真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第1ポリヌクレオチドと、(ii)発現させるべきタンパク質をコードする第2ポリヌクレオチド、およびプロモーターを含むポリヌクレオチドであり、かつ当該第2ポリヌクレオチドが当該プロモーターに制御可能に連結されている第3ポリヌクレオチドとを、哺乳動物細胞へ同時に導入する導入工程、並びに
当該第1および第3ポリヌクレオチドが導入された哺乳動物細胞を選抜する選抜工程を行なって、第2ポリヌクレオチドを増幅する場合において、
以下に示される(I)の条件および(II)の条件を満たすことを特徴とする遺伝子増幅効率を増加させる方法:
(I)上記導入工程において、第1ポリヌクレオチドおよび第3ポリヌクレオチドと同時に、逆方向反復配列よりなるポリヌクレオチドを哺乳動物細胞へ導入する
(II)上記プロモーターは、所定の操作によって転写活性が活性化または不活性化される転写活性調節型プロモーターであり、転写活性調節型プロモーターの転写活性が不活性化された状態で導入工程および選抜工程を行なう。

【請求項2】
 
上記逆方向反復配列よりなるポリヌクレオチドが、回文配列よりなるポリヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
上記真核生物細胞内で機能する複製起点が、c-myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、またはβ-グロビン遺伝子座の複製起点に由来することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
 
上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、またはジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域に由来することを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
 
請求項1に記載の方法を行なうためのキットであって、
真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含むポリヌクレオチドと、逆方向反復配列よりなるポリヌクレオチド、所定の操作によって転写活性が活性化または不活性化される転写活性調節型プロモーターを含むポリヌクレオチドとを含むことを特徴とするキット。

【請求項6】
 
上記逆方向反復配列よりなるポリヌクレオチドが、回文配列よりなるポリヌクレオチドである、請求項5に記載のキット。

【請求項7】
 
上記真核生物細胞内で機能する複製起点が、c-myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、またはβ-グロビン遺伝子座の複製起点に由来することを特徴とする請求項5または6に記載のキット。

【請求項8】
 
上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、またはジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域に由来することを特徴とする請求項5から7のいずれか1項に記載のキット。

【請求項9】
 
発現させるべきタンパク質をコードする目的遺伝子、およびプロモーターを含むポリヌクレオチドであり、かつ当該目的遺伝子が当該プロモーターに制御可能に連結されているポリヌクレオチドを、哺乳動物細胞へ同時に導入する導入工程、並びに
上記ポリヌクレオチドが導入された哺乳動物細胞を選抜する選抜工程を行なって、上記目的遺伝子を増幅する場合において、以下に示される(I)の条件および(II)の条件を満たすことを特徴とする遺伝子増幅効率を増加させる方法:
(I)上記導入工程において、上記ポリヌクレオチドと同時に、逆方向反復配列よりなるポリヌクレオチドを哺乳動物細胞へ導入する
(II)上記プロモーターは、所定の操作によって転写活性が活性化または不活性化される転写活性調節型プロモーターであり、転写活性調節型プロモーターの転写活性が不活性化された状態で導入工程および選抜工程を行なう。

【請求項10】
 
上記逆方向反復配列よりなるポリヌクレオチドが、回文配列よりなるポリヌクレオチドである、請求項9に記載の方法。

【請求項11】
 
請求項9に記載の方法を行なうためのキットであって、
逆方向反復配列よりなるポリヌクレオチド、所定の操作によって転写活性が活性化または不活性化される転写活性調節型プロモーターを含むポリヌクレオチドとを含むことを特徴とするキット。

【請求項12】
 
上記逆方向反復配列よりなるポリヌクレオチドが、回文配列よりなるポリヌクレオチドである、請求項11に記載のキット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered


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