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METHOD FOR DETECTING ENTEROBACTERIACEAE BACTERIA

Patent code P130009924
File No. S2011-1017-N0
Posted date Sep 27, 2013
Application number P2012-035637
Publication number P2013-169190A
Patent number P5867147
Date of filing Feb 21, 2012
Date of publication of application Sep 2, 2013
Date of registration Jan 15, 2016
Inventor
  • (In Japanese)木村 凡
  • (In Japanese)▲高▼橋 肇
  • (In Japanese)田中 悠一郎
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人東京海洋大学
Title METHOD FOR DETECTING ENTEROBACTERIACEAE BACTERIA
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a primer set for a nucleic acid amplification method that can specifically detect only enterobacteriaceae bacteria without going through a culture process.
SOLUTION: A primer set for detecting enterobacteriaceae bacteria includes a forward primer comprising nucleotide including a base sequence of 17 consecutive bases or more in a base sequence or the like comprising a specific sequence, and a reverse primer comprising nucleotide including a base sequence or the like comprising a specific sequence different from the base sequence in the forward primer.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

食品微生物検査では、検査結果の迅速性及び正確性が検査対象物の鮮度を保持し、食品の安全性を確保する上で極めて重要である。従来の食品微生物検査では、微生物の培養工程を含む所定の試験が行われてきた(非特許文献1及び2)。しかし、培養工程を含む検査方法では、培養期間が律速となり、検査結果が出るまでに3日~1週間を要してしまうという時間的な問題があった。

近年では、PCR法を用いた分子生物学的手法による衛生指標菌の検出や定量が行われている。衛生指標菌とは、サルモネラ菌や赤痢菌のような腸管系食中毒菌と由来が同じであるか、又はそれらと挙動を共にする可能性が高い細菌であり、食品の衛生的な取り扱いの良否及び腸管系食中毒菌による食品の汚染の有無を推定するための指標として用いられている。

ところで、従来、日本で衛生指標菌といえば、大腸菌群や糞便系大腸菌群が該当していた。それ故、食品微生物検査においても、PCR法を用いた大腸菌群の検出及び定量が採用されている(非特許文献3)。しかし、大腸菌群の定義は、乳糖分解性細菌であり、乳糖非分解性細菌であるサルモネラ菌や赤痢菌等の食品衛生上重要な腸管系食中毒菌が衛生指標菌に包含されないという大きな問題があった。2006年より欧州を中心に食品微生物検査における検査対象細菌を大腸菌群からブドウ糖分解性を指標とする腸内細菌科菌群とする移行が進んできている。それ故、腸内細菌科菌群を分子生物学的手法により迅速かつ特異的に検出する新たな方法が求められている。

腸内細菌科菌群は、ブドウ糖を分解して酸を産生すること及びオキシダーゼ反応陰性であることで特徴付けられるが、それらに該当する細菌は非常に多岐に亘るため、腸内細菌科菌群のみが有し、かつ核酸増幅の標的となり得る特異的な遺伝子は存在しない。それ故、ハウスキーピング遺伝子である16SrRNAやRpoB、gyrB等の遺伝子を標的遺伝子とした腸内細菌科菌群の検出方法が開発されている。しかし、いずれの遺伝子を用いた方法も腸内細菌科菌群のみを特異的に検出することはできず、擬陽性率が高いか、逆に偽陰性率が高い等、検出精度の面において問題があった。以上の理由から、現在まで腸内細菌科菌群のみを特異的に検出し得る核酸増幅法は確立されていない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、腸内細菌科菌群検出用プライマーセット、腸内細菌科菌群検出キット及び腸内細菌科菌群検出方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
配列番号1で示される塩基配列、又は配列番号1で示される塩基配列において1~3個の塩基が付加、欠失又は置換した塩基配列、における連続する17塩基以上の塩基配列を含むヌクレオチドで構成されるフォワードプライマー、及び
配列番号2で示される塩基配列、又は配列番号2で示される塩基配列において1~3個の塩基が付加、欠失又は置換した塩基配列、を含むヌクレオチドで構成されるリバースプライマー
からなる、腸内細菌科菌群検出用プライマーセット。

【請求項2】
 
前記リバースプライマーが配列番号3で示される塩基配列を含むヌクレオチドで構成される、請求項1に記載の腸内細菌科菌群検出用プライマーセット。

【請求項3】
 
前記フォワードプライマーが配列番号4で示される塩基配列、又は配列番号4で示される塩基配列において1~3個の塩基が付加、欠失又は置換した塩基配列、を含むヌクレオチドで構成される、請求項1又は2に記載の腸内細菌科菌群検出用プライマーセット。

【請求項4】
 
前記フォワードプライマーが配列番号5で示される塩基配列を含むヌクレオチドで構成される、請求項3に記載の腸内細菌科菌群検出用プライマーセット。

【請求項5】
 
前記フォワードプライマー及びリバースプライマーが50塩基以下のヌクレオチドで構成される、請求項1~4のいずれか一項に記載の腸内細菌科菌群検出用プライマーセット。

【請求項6】
 
請求項1~5のいずれか一項に記載の腸内細菌科菌群検出用プライマーセットを備えた腸内細菌科菌群検出キット。

【請求項7】
 
腸内細菌科菌群検出方法であって、
試料から核酸を抽出する抽出工程、
前記核酸抽出工程で抽出した核酸を鋳型として請求項1~5のいずれか一項に記載の腸内細菌科菌群検出用プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う増幅工程、
前記増幅工程後の増幅産物量に基づいて前記試料における腸内細菌科菌群の陽性又は陰性を判定する判定工程
を含む前記方法。

【請求項8】
 
前記増幅工程において定量的核酸増幅法を用いる、請求項7に記載の腸内細菌科菌群検出方法。

【請求項9】
 
前記判定工程は、前記増幅工程後の増幅産物量が腸内細菌科菌群を含まない対照試料の増幅産物量に対して統計学的に有意に多い場合に前記試料が腸内細菌科菌群陽性であると判定する、請求項7又は8に記載の腸内細菌科菌群検出方法。

【請求項10】
 
前記試料が食品である、請求項7~9のいずれか一項に記載の腸内細菌科菌群検出方法。

【請求項11】
 
腸内細菌科菌群定量方法であって、
試料から核酸を抽出する抽出工程、
前記核酸抽出工程で抽出した核酸を鋳型として請求項1~5のいずれか一項に記載の腸内細菌科菌群検出用プライマーセットを用いて定量的核酸増幅反応を行う定量増幅工程、

前記定量増幅工程で得られるCt値を検量式に代入して試料中の腸内細菌科菌群を定量的に測定する測定工程
を含み、
前記検量式は、既知菌数の段階希釈試料から抽出した核酸を鋳型として請求項1~5のいずれか一項に記載の腸内細菌科菌群検出用プライマーセットを用いて定量的核酸増幅反応を行うことにより各段階希釈試料の増幅産物量に基づいて導き出される式である
前記方法。

【請求項12】
 
前記検量式がCt値=-3(logCFU/g)+37)である、請求項11に記載の腸内細菌科菌群定量方法。

【請求項13】
 
前記試料が食品である、請求項11又は12に記載の腸内細菌科菌群定量方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered


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