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MUTANT-TYPE RNA POLYMERASE β-SUBUNIT GENE commons meetings

Patent code P130010112
Posted date Nov 29, 2013
Application number P2013-003150
Publication number P2013-162785A
Patent number P6139139
Date of filing Jan 11, 2013
Date of publication of application Aug 22, 2013
Date of registration May 12, 2017
Priority data
  • P2012-002943 (Jan 11, 2012) JP
Inventor
  • (In Japanese)田村 隆
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人岡山大学
Title MUTANT-TYPE RNA POLYMERASE β-SUBUNIT GENE commons meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a mutant-type rpoB gene capable of activating secondary metabolism in a cell based on elucidation of the regulation mechanism of secondary metabolism by a rpoB gene, and consequently a cell of Actinomyces or the like having the activated secondary metabolism.
SOLUTION: There is disclosed a mutant-type rpoB gene in which mutation is introduced into a rpoB gene. The rpoB gene is a gene encoding RNA polymerase β-subunit comprising a site corresponding to a specific amino acid sequence. The mutation causes substitution of two or more amino acids in the amino acid sequence and the activity of RNA polymerase is reinforced by the mutation.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年、病原性ウイルスの世界的、地域的流行が目立って頻発するようになってきている。現在処方可能な抗生物質のほとんどはウイルスには無効であり、感染拡大が始まればそれを押さえ込むのは容易ではない。ウイルス、原虫、がん細胞などに強い薬効を示す一群の抗生物質群が存在する。これらの抗生物質群は、核酸系抗生物質に分類され、遺伝情報の保存・発現を司るDNAやRNAの構成成分として知られるヌクレオシドやヌクレオチドの機能に関連する物質であり、優れた薬効を有することが知られている。しかしながら核酸系抗生物質は、放線菌等による生産量が極めて微量であり、工業的生産が困難であるため、社会的に活用されるに至っていない。

放線菌等のrpoB遺伝子への変異導入により、細胞内において二次代謝が活性化され、細胞内における物質の生産量が高められることが知られている。当該変異は、rpoB遺伝子のリファンピシン結合部位に導入されたものである(特許文献1、非特許文献1~4)。リファンピシンは抗生物質の一種であり、rpoBのリファンピシン結合部位に変異が見られる自然突然変異株がリファンピシンに対する耐性を獲得することが報告されている。

rpoBのリファンピシン結合部位の変異は、二次代謝の活性化を伴う。二次代謝の活性化のメカニズムとして、グアノシン4リン酸(ppGpp)結合状態の模倣が提唱されてきた。細菌は、タンパク質の原料であるアミノ酸が足りなくなってきた場合、ppGppを合成する。ppGppは、転写を担うRNAポリメラーゼと複合体をつくり、アミノ酸を増やすような役割、例えばリボソームRNA(rRNA)やトランスファーRNA(tRNA)の合成を抑制し、タンパク質合成を抑制したり、逆に、アミノ酸の生合成や輸送に必要なタンパク質の合成を促進したりすることが知られている。

しかしながら近年、rpoB遺伝子とppGppとの結晶構造モデルが報告され、ppGpp結合箇所とリファンピシン結合部位がかけはなれた位置にあることが分かった(非特許文献5)。rpoB遺伝子の二次代謝の調節のメカニズムはいまだ解明されないままとなっている。rpoB遺伝子の二次代謝調節メカニズムが明らかになれば、放線菌等の細胞における二次代謝の活性化を、戦略的かつ効率的に確立することができる。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、変異型RNAポリメラーゼβ-サブユニット遺伝子(変異型rpoB遺伝子)、当該変異型rpoB遺伝子が導入された細胞、および当該細胞を用いて目的物質を産生する方法に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
rpoB遺伝子に変異が導入された変異型rpoB遺伝子が導入された放線菌であり、rpoB遺伝子が配列番号1に記載のアミノ酸配列に相当する部位を含むRNAポリメラーゼβ-サブユニットをコードする遺伝子であり、前記変異が、配列番号1における1番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換、11番目のヒスチジンのアルギニンもしくはチロシンへの置換、及び14番目のアルギニンのヒスチジン、フェニルアラニンもしくはシステインへの置換から選択される少なくとも2つの置換をもたらす変異を含み、前記変異によりRNAポリメラーゼの活性が増強する、放線菌

【請求項2】
 
前記変異が、配列番号1における1番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換と、14番目のアルギニンのフェニルアラニンへの置換をもたらす変異からなる、請求項1に記載の放線菌。

【請求項3】
 
野生型のrpoB遺伝子が破壊されている、請求項1又は2に記載の放線菌。

【請求項4】
 
相同組換えによりrpoB遺伝子に変異が導入された変異型rpoB遺伝子が導入された放線菌を作製する方法であって、rpoB遺伝子が配列番号1に記載のアミノ酸配列に相当する部位を含むタンパク質をコードする遺伝子であり、変異型rpoB遺伝子における変異が、配列番号1における1番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換、11番目のヒスチジンのアルギニンもしくはチロシンへの置換、及び14番目のアルギニンのヒスチジン、フェニルアラニンもしくはシステインへの置換から選択される少なくとも2つの置換をもたらす変異を含み、相同組換えが、5'末端の塩基が欠損した変異型rpoB遺伝子を含有するベクターを用いて行われ、相同組換えの結果、放線菌内の野生型rpoB遺伝子が破壊される、方法。

【請求項5】
 
請求項1~3のいずれかに記載の放線菌を用いて、目的物質を産生する方法。

【請求項6】
 
目的物質を、1のアミノ酸置換をもたらす変異が導入された変異型rpoB遺伝子を含む放線菌に比べて、増大した量で産生しうる、請求項5に記載の産生方法。

【請求項7】
 
目的物質が、抗生物質である、請求項5または6に記載の産生方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2013003150thum.jpg
State of application right Registered
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