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METHOD AND KIT FOR QUANTIFICATION OF SPHINGOMYELIN

Patent code P140010218
File No. S2012-0734-N0
Posted date Jan 23, 2014
Application number P2012-131977
Publication number P2013-255436A
Patent number P6315880
Date of filing Jun 11, 2012
Date of publication of application Dec 26, 2013
Date of registration Apr 6, 2018
Inventor
  • (In Japanese)森田 真也
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人滋賀医科大学
Title METHOD AND KIT FOR QUANTIFICATION OF SPHINGOMYELIN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method and kit for quantification of sphingomyelin which enable highly specific, highly sensitive, and easy quantification of sphingomyelin.
SOLUTION: A method for quantification of sphingomyelin in a sample includes following steps: (1) acting a sphingomyelinase, an alkaline phosphatase, a choline oxidase, and a peroxidase on the sample in the presence of a nonionic surfactant (the sphingomyelinase is derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus); and (2) measuring the fluorescence intensity, absorbance or light emission amount of compounds generated in the step (1) to determine the amount of sphingomyelin from a predetermined calibration curve. A kit for quantification of sphingomyelin comprises a sphingomyelinase, an alkaline phosphatase, a choline oxidase, a peroxidase, and a nonionic surfactant (the sphingomyelinase is derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus).
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

スフィンゴミエリン(SM)は主要なスフィンゴ脂質であり、全ての動物及び植物、並びにある種の原核生物における細胞膜の必須の成分である。動物において、SMは細胞膜、ミエリン鞘、及び血漿リポタンパク質に存在する。

SMは、細胞膜上のマイクロドメインである脂質ラフトの構成成分であり、様々な細胞内シグナル伝達や、レセプター・チャネル・トランスポーターなどの膜タンパク質の活性調節に関わる。

セラミド、スフィンゴシン、及びスフィンゴシン1-リン酸を含むSMの代謝産物は、細胞増殖、分化、及びアポトーシスの重要な制御因子として働く。リソソーム病の一種であるニーマン-ピック病は、酸性スフィンゴミエリナーゼ(sphingomyelinase) (SMase)酵素の活性が欠失し、細胞、組織、及び体液におけるSMの蓄積が原因である。ヒトの血漿SMレベルは、冠動脈疾患の危険因子であると報告されている。SMは、リポタンパク質表面の構造的及び機能的成分であり、リポタンパク質の代謝において重要な役割をする。

それ故、SMの定量は、様々な生物学的プロセスの理解のために重要である。質量分析は、SM分子種の同定及び相対的定量のために使用されている。しかし、SMの全濃度を質量分析により決定することは困難である。蒸発光散乱検出器を備えたHPLCはSMを定量するために用いられるが、感度の限界が200 ng (約280 pmol)である。

SMの酵素定量法は、簡単、迅速、高感度、ハイスループットであり、特殊な装置が必要でない(例えば、特許文献1、非特許文献1~5)。酵素定量法は、様々な細胞プロセス、タンパク質の機能、及びSM代謝に関する疾患を研究するために便利である。SMを定量するための酵素蛍光法は、比色検出システムを用いた類似の方法より感度が高い(非特許文献1)。しかしながら、酵素定量法の特異性及び精度についてはあまり評価されていない。

非特許文献1では、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase)、コリンオキシダーゼ(choline oxidase)、及びペルオキシダーゼ(peroxidase)の四酵素を使用したスフィンゴミエリンの定量方法、並びにこの定量方法によりスフィンゴミエリンの定量が0.02~20 nmolの範囲で可能であることが記載されている。

非特許文献2及び特許文献1では、上記と同様の四酵素系を使用したスフィンゴミエリンの定量方法、並びにSM測定において線形性がある範囲が0.5~5μg (約0.7~7 nmol)であることが記載されている。

非特許文献3では、上記と同様の四酵素系を使用したスフィンゴミエリンの定量方法、並びにこのアッセイにおける線形性がある範囲が10~120μg/dLであることが記載されている。

非特許文献4及び5でも、上記と同様の四酵素系を使用したスフィンゴミエリンの定量方法が記載されている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、酵素を使用したスフィンゴミエリンの定量方法、及びスフィンゴミエリンの定量用キットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の工程を有する試料中のスフィンゴミエリンの定量方法:
(1)(a)試料にスフィンゴミエリナーゼ及びアルカリホスファターゼを非イオン性界面活性剤の存在下に作用させる工程(該スフィンゴミエリナーゼはバチルス属に属する微生物由来のものである)であって、該非イオン性界面活性剤の濃度が0.01~1容量%である、工程、
(1)(b)工程(1)(a)で得られた試料にコリンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジンの存在下に作用させる工程、並びに
(2)工程(1)(b)で生成する化合物の蛍光強度を測定し、予め求めた検量線からスフィンゴミエリンを定量する工程。

【請求項2】
 
前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルである、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
前記スフィンゴミエリナーゼがバチルス・セレウスに属する微生物由来のものである、請求項1又は2に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered


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