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SERUM-FREE MEDIUM FOR CULTURING DIGESTIVE SYSTEM CANCER STEM CELL AND METHOD FOR PROLIFERATING DIGESTIVE SYSTEM CANCER STEM CELL USING THE SAME

Patent code P140010583
File No. H23-063,S2012-0505-N0
Posted date May 29, 2014
Application number P2012-181102
Publication number P2013-208104A
Patent number P6090735
Date of filing Aug 17, 2012
Date of publication of application Oct 10, 2013
Date of registration Feb 17, 2017
Priority data
  • P2012-047433 (Mar 2, 2012) JP
Inventor
  • (In Japanese)吉村 清
  • (In Japanese)恒富 亮一
  • (In Japanese)渡邊 裕策
  • (In Japanese)岡 正朗
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山口大学
Title SERUM-FREE MEDIUM FOR CULTURING DIGESTIVE SYSTEM CANCER STEM CELL AND METHOD FOR PROLIFERATING DIGESTIVE SYSTEM CANCER STEM CELL USING THE SAME
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a serum-free medium for culturing digestive system cancer stem cells, a method for culturing digestive system cancer stem cells, particularly a method for stably proliferation culturing for a long period of time.
SOLUTION: Digestive system cancer stem cells are proliferated for over three months by suspension culturing cells isolated from a digestive system cancer cell specimen in a serum-free medium added with transferrin, insulin, putrescine, progesterone, an epidermal growth factor (EGF), a basic fibroblast growth factor (Basic FGF) and a leukemia inhibitory factor (LIF) in addition to neural survival factor-1, to form a cell aggregate (Sphere) of the digestive system cancer stem cells, isolating the sphere, adhesion culturing the same in the serum-free culture medium by using an incubator coated with cell adhering molecules, and continuing the culture by gradually substituting a part of the serum-free medium with a fresh serum-free medium.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

哺乳類などの多細胞生物において、組織を構成する細胞は、大きく分化細胞と幹細胞とに分けられる。分化細胞は、組織特有の機能を発揮する成熟した細胞である。他方、幹細胞は、活発な増殖能、分化能及び自己複製能を有する細胞である。分化細胞は、細胞老化や細胞損傷により細胞死するため、組織特有の機能を維持するための供給源が必要となるが、かかる供給源としての役割を担う細胞が幹細胞である。幹細胞による組織構築のシステム(幹細胞システム)において、分化細胞の多くは、それぞれの組織中に存在する体性幹細胞を起源とすることが多く、例えば血液系の細胞は造血幹細胞から、肝細胞は肝幹細胞から、また、神経系の細胞は神経幹細胞から分化することが知られている。

幹細胞システムは、がん組織においても同様に存在している可能性が示唆されている。がん組織における一部のがん細胞には、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞に特徴的な性質である、自身と同じ細胞を作り出す自己複製能と多種類の細胞に分化できる多分化能とを有するがん細胞(がん幹細胞[cancer stem cells;CSCs])が存在し、かかるがん幹細胞が、自己複製能により自身と同じ細胞を維持しながら、多分化能によりがん組織における多数の分化したがん細胞を生み出していると考えられている。

がん幹細胞の存在は、すでに1970年代に示唆されていたが、それを実験的に証明することが技術的に困難であった。しかし、フローサイトメトリーの発展によって特定の細胞集団のみを分離することが可能になったことや、正常組織の体性幹細胞の解析が進んだことや、がん細胞の移植により腫瘍形成を評価できる免疫不全マウスなどの実験モデル動物が開発されたことなどによって、血液のがんである白血病で、がん幹細胞の存在が確認された(非特許文献1)。その後、白血病におけるがん幹細胞仮説を基に、CD133等の幹細胞マーカーを発現しているがん幹細胞が乳がん、脳腫瘍、大腸癌等のがん組織において存在することが知られている。

がん幹細胞は、がん発生のメカニズムを解明する上で重要なツールであるとともに、がん細胞が他の臓器に転移するためには、がん細胞が原発巣から遊離するだけではなく、到達した部位で新しくがんを形成する能力が必要となることから、転移のメカニズムや治療方法を確立する上でも重要なツールであると考えられている(非特許文献2)。

また、一般的な抗がん剤による治療において、固形腫瘍の縮小が治療の指針とされていることから、かかる治療に用いられる抗がん剤の標的は、がん幹細胞ではなく、腫瘍の大部分を占める分化したがん細胞である可能性が考えられる。実際に、がん幹細胞の中には、薬剤耐性を獲得しているものがあることが報告されている(非特許文献3)。したがって、治療によって大部分のがん細胞を除いても、ごく少数のがん幹細胞が生き残っていれば再発が起こりうることになり、これが、がんにおいてしばしば再発が起きる理由の一つとして考えられている。したがって、がん幹細胞を標的として除去することができれば、がんの転移や再発の防止にも有用な治療法の開発につながることが期待されている。

このためには、がん幹細胞を単離して培養する技術の確立が必要不可欠であるが、がん幹細胞を単離する方法としては、フローサイトメトリーによるソーティング法や、非接着条件下で浮遊培養することにより浮遊細胞塊を形成させる方法(特許文献1)等が知られているものの、がん幹細胞を培養する方法、特に長期間安定して増殖培養する方法については、ほとんど確立されていないのが現状であった。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地や、かかる無血清培地を用いた消化器系がん幹細胞の増殖方法や、消化器系がん幹細胞の集団に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、神経生存因子-1(NSF-1)、トランスフェリン、インスリン、プトレシン、プロゲステロン、上皮成長因子(EGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(Basic FGF)、及び白血病抑制因子(LIF)を添加してなることを特徴とする消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地。

【請求項2】
 
亜セレン酸又はその塩、ヘパリン、及びN-アセチルシステインをさらに添加してなることを特徴とする、請求項1記載の無血清培地。

【請求項3】
 
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地が、グルコース添加DMEM/F12であることを特徴とする、請求項1又は2記載の無血清培地。

【請求項4】
 
以下の工程(a)及び(b)を備えたことを特徴とする消化器系がん幹細胞の増殖方法。
(a)消化器系がん細胞を、請求項1~3のいずれか記載の無血清培地中で浮遊培養し、消化器系がん幹細胞の細胞塊(Sphere)を形成させる工程;
(b)前記細胞塊を単離し、単離した細胞塊を、細胞接着分子をコーティングした培養器を用いて前記無血清培地中で接着培養することにより、消化器系がん幹細胞を増殖させる工程;

【請求項5】
 
細胞接着分子が、ラミニンであることを特徴とする請求項4記載の増殖方法。

【請求項6】
 
工程(b)の後に、無血清培地の一部を、新しい無血清培地で置換して培養を継続する工程(c)を備えたことを特徴とする請求項4又は5記載の増殖方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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