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METHOD FOR PREPARING RECOMBINANT HUMAN PANCREATIC LIPASE meetings

Patent code P140010584
File No. 12-0107
Posted date May 30, 2014
Application number P2012-263442
Publication number P2014-108073A
Patent number P6086378
Date of filing Nov 30, 2012
Date of publication of application Jun 12, 2014
Date of registration Feb 10, 2017
Inventor
  • (In Japanese)小川 温子
  • (In Japanese)相川 京子
  • (In Japanese)富田 千尋
  • (In Japanese)楢舘 里奈
  • (In Japanese)樋上 智子
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人お茶の水女子大学
Title METHOD FOR PREPARING RECOMBINANT HUMAN PANCREATIC LIPASE meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for mass production of recombinant human pancreatic lipase having a specific activity close to that of the natural swine pancreatic lipase.
SOLUTION: Provided is a method for preparing recombinant human pancreatic lipase (recHPL) comprising the sequential steps of: (a) constructing an expression plasmid by adding Strep-tagII to the C terminus of HPL cDNA; (b) introducing the constructed expression plasmid into E. coli to culture the E. coli for expression of HPL in the cells; (c) purifying HPL by one step from the cell lysate using Sepharose bearing Strep-Tactin; and (d) refolding the purified HPL for activation by using the stepwise dialysis method with glycerol in which urea concentration is lowered stepwise in the presence of Ca2+.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

ヒト膵リパーゼ(E.C.3.1.1.3.)は、膵腺房細胞で合成され膵液中に分泌される分子量約4万8千の糖タンパク質である。膵リパーゼはトリグリセリドのα位脂肪酸エステルを加水分解し、ジグリセリド成分と遊離の脂肪酸へ分解する。

ヒト膵リパーゼの大量発現法としては、昆虫細胞sf6を用いて発現させる方法(例えば、非特許文献1参照)、チャイニーズハムスター由来細胞V79を用いて発現させる方法(例えば、非特許文献2参照)、酵母を用いて発現させる方法(例えば、非特許文献3参照)が知られている。しかし、これらの方法はいずれもコストが非常にかかる上、発現に6~10日間を要する。また、いずれの方法においても、リパーゼにヒト型ではない糖鎖が修飾される場合があるため、ヒトがこれらリパーゼを摂取するとアレルギーが引き起こされたり、生体内での安定性が変わる可能性があり、安全性に乏しいと言える。このため、より短期間で発現でき、かつ糖鎖の修飾が起こらない、大腸菌を用いた大量発現方法の開発が求められている。

他方、大腸菌を用いてリパーゼを発現させる方法としては、ジオバチルス属の耐熱性T1リパーゼをGSTタグを組み込んだ融合タンパクとして発現させる方法(例えば、特許文献1参照)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の成熟リパーゼ(SAL3)を、N末端側にHis6タグを組み込んだ融合タンパクとして発現させる方法(例えば、非特許文献4参照)、Candida antarctica由来のリパーゼを、N末端側にFLAGタグ、あるいはC末端側にHis6タグを組み込んだ融合タンパクとしてそれぞれ発現させる方法(例えば、非特許文献5参照)、Ralstonia sp.M1由来のリパーゼを、His6タグを組み込んだ融合タンパクとして発現させる方法(例えば、非特許文献6参照)が知られている。また、デンプン結合性タンパク質(SBP)タグを使用する、大腸菌で発現した組換えリパーゼの精製方法(例えば、特許文献2参照)も知られている。これらタグ付きリパーゼにはいずれも酵素活性がみられているが、大量発現系の確立には至っておらず、また、微生物由来のリパーゼとは構造の異なるヒト型リパーゼを大腸菌で発現させる方法については一切考慮されていない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、組換えヒト膵臓リパーゼ(recHPL)の調製方法、より詳しくは、C末側にStrep-tagIIを付加して精製したHPLを、段階透析法を利用してリフォールディングするrecHPLの調製方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
a)ヒト膵臓リパーゼ(HPL)のcDNAに、Strep-tagIIをC末側に付加した発現プラスミドを構築する工程;
(b)構築した発現プラスミドを大腸菌に導入した後に培養して、大腸菌内にHPLを発現させる工程;
(c)前記大腸菌を破砕した大腸菌溶解物から、ストレプタクチンを担持したセファロースを用いてHPLをワンステップで精製する工程;及び、
(d)精製したHPLを、グリセロール添加段階透析法を用いて活性化するリフォールディング工程;
を備え、
前記グリセロール添加段階透析法が、10%グリセロール及び2.5~5mM Ca2+を添加し、酸化剤/還元剤としてシスチン/システインを用い、及び、尿素濃度を8Mから0Mに段階的に低下させるグリセロール添加段階透析法であることを特徴とする組換えヒト膵臓リパーゼ(recHPL)の調製方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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