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BIOLOGICAL NITROGEN FIXATION REGULATOR AND USE THEREOF commons

Patent code P140010679
File No. NU-0540,S2014-0707-N0
Posted date Jul 1, 2014
Application number P2014-054088
Publication number P2015-173652A
Patent number P6489676
Date of filing Mar 17, 2014
Date of publication of application Oct 5, 2015
Date of registration Mar 8, 2019
Inventor
  • (In Japanese)藤田 祐一
  • (In Japanese)辻本 良真
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人名古屋大学
Title BIOLOGICAL NITROGEN FIXATION REGULATOR AND USE THEREOF commons
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To identify genes which achieve biological nitrogen fixation in a photosynthetic organism by expressing nitrogenase and to provide application of the genes to the organism that does not fix nitrogen.
SOLUTION: The invention provides a transformant which has activation of expression of genes encoding any protein selected from a protein having a specific amino acid sequence, a protein having an amino acid sequence with homology of 50% or more to the amino acid sequence and functionally equivalent to the protein, and a protein having an amino acid sequence with substitution, deletion, insertion or addition of one or amino acids in the amino acid sequence and functionally equivalent to the protein. The invention provides a transformant having one or more activities of gene/genes selected from a nitrogen fixation gene cluster derived from a cyanobacterium, being enhanced in nitrogen fixation by nitrogenase, and being inductively enhanced in nitrogen fixation under conditions of low oxygen and nitrogen exhaustion.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

作物の生産性は、大量の化学肥料に依存している。化学肥料は、高いエネルギーコストのかかる工業的な窒素固定、空気中に存在する窒素分子を安定な窒素化合物に変換するプロセスによって生産され、その過程で大量の化石燃料が消費されている。

限られた原核生物が窒素固定を行うことが知られている(生物窒素固定)。生物窒素固定とは、ニトロゲナーゼによって分子状窒素がアンモニアに変換される過程をいう。生物窒素固定には、ニトロゲナーゼの構造遺伝子のみならず、その活性中心となる金属クラスターの生合成や還元力供給などの多数の遺伝子が関わっていると考えられている(非特許文献1)。

窒素固定を行う原核生物としては、例えば、Leptolyngbya boryana(L. boryana)が挙げられる。L. boryanaは、いわゆるシアノバクテリアであって、嫌気条件下でヘテロシストを形成せずに窒素固定を行う糸状性シアノバクテリアである。このシアノバクテリアは、ヘテロシストを形成しないため、同一細胞内において光合成と窒素固定とを行うという特徴も有している(非特許文献2)。

Field of industrial application (In Japanese)

本明細書は、生物による窒素固定(生物窒素固定)を制御する因子及びその利用に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の(a)~(e):
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1個~30個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を有し、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質と機能的に同等なタンパク質
(d)配列番号1で表される塩基配列でコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質
(e)配列番号1で表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるタンパク質であって、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質
から選択されるいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える、形質転換体。

【請求項2】
 
L.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかの制御下にニトロゲナーゼをコードする遺伝子を発現可能に備える、請求項1に記載の形質転換体。

【請求項3】
 
低酸素及び窒素枯渇条件下で誘導的に前記窒素固定が増強可能である、請求項2に記載の形質転換体。

【請求項4】
 
さらに、シアノバクテリア由来の窒素固定遺伝子群から選択される1種又は2種以上の遺伝子を発現可能に備える、請求項1~3のいずれかに記載の形質転換体。

【請求項5】
 
前記窒素固定遺伝子群は、L. boryanaの窒素固定遺伝子群である、請求項4に記載の形質転換体。

【請求項6】
 
さらに、以下の(f)~(j)のいずれかに記載のタンパク質;
(f)配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(g)配列番号4で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、L. boryanaにおいて構成的に発現され、かつ低酸素条件下でクロロフィル・ヘム・ビリン色素の生合成に関わる遺伝子の発現の誘導活性を有するタンパク質
(h)配列番号4で表されるアミノ酸配列において1個~30個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を有し、L. boryanaにおいて構成的に発現され、かつ低酸素条件下でクロロフィル・ヘム・ビリン色素の生合成に関わる遺伝子の発現の誘導活性を有するタンパク質
(i)配列番号3で表される塩基配列でコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質
(j)配列番号3で表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるタンパク質であって、L. boryanaにおいて構成的に発現され、かつ低酸素条件下でクロロフィル・ヘム・ビリン色素の生合成に関わる遺伝子の発現の誘導活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を発現可能に備える、請求項1~5のいずれかに記載の形質転換体。

【請求項7】
 
前記形質転換体は、光合成生物体である、請求項1~6のいずれかに記載の形質転換体。

【請求項8】
 
前記光合成生物体は、シアノバクテリアである、請求項7に記載の形質転換体。

【請求項9】
 
前記光合成生物体は、植物体である、請求項7に記載の形質転換体。

【請求項10】
 
以下の(a)~(e):
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1個~30個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を有し、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質
(d)配列番号1で表される塩基配列でコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質
(e)配列番号1で表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるタンパク質であって、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質
から選択されるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、形質転換ベクター。

【請求項11】
 
請求項1~9のいずれかに記載の形質転換体の製造方法であって、
宿主生物細胞に、以下の(a)~(e):
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1個~30個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を有し、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質
(d)配列番号1で表される塩基配列でコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質
(e)配列番号1で表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるタンパク質であって、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質
から選択されるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入して形質転換する工程、
を備える、製造方法。

【請求項12】
 
窒素固定を利用して有用物質を生産する方法であって、
請求項1~9のいずれかに記載の形質転換体に窒素を固定させて、前記形質転換体を生育又は増殖させて有用物質を生産する工程、
を備える、生産方法。

【請求項13】
 
前記形質転換体は、光合成生物体である、請求項12に記載の生産方法。

【請求項14】
 
前記光合成生物体は、シアノバクテリア又は植物体である、請求項12に記載の生産方法。

【請求項15】
 
窒素固定を利用して生物体を生産する方法であって、
前記生物体としての請求項1~9のいずれかに記載の形質転換体に窒素を固定させて、前記形質転換体を生育又は増殖させる工程、
を備える、生産方法。

【請求項16】
 
低酸素及び窒素枯渇条件下で作動可能な転写制御因子のスクリーニング方法であって、
以下の(b)、(c)及び(e):
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1個~30個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を有し、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質
(e)配列番号1で表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるタンパク質であって、低酸素及び窒素枯渇条件下においてL.boryanaの窒素固定遺伝子群のnifB-nifP遺伝子間領域1255bp(配列番号5)に含まれている2つのプロモーターのうちいずれかに作用して当該特定プロモーターによって作動可能に連結される遺伝子の発現の増強活性を有するタンパク質から選択される1種又は2種以上の被験タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された非窒素固定生物体における低酸素及び窒素化合物枯渇条件下での前記被験タンパク質による1又は2以上の窒素固定遺伝子の発現増強を評価する工程、
を備える、スクリーニング方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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