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METHOD FOR PROMOTING TRANSFER OF TARGET mRNA FROM NUCLEUS TO CYTOPLASM, METHOD FOR PROTEIN EXPRESSION AND MANUFACTURING, AND KIT USING THE SAME achieved

Patent code P140010875
File No. 3816,S2012-0645-N0
Posted date Aug 11, 2014
Application number P2012-165287
Publication number P2014-023459A
Patent number P6099075
Date of filing Jul 26, 2012
Date of publication of application Feb 6, 2014
Date of registration Mar 3, 2017
Inventor
  • (In Japanese)増田 誠司
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人京都大学
Title METHOD FOR PROMOTING TRANSFER OF TARGET mRNA FROM NUCLEUS TO CYTOPLASM, METHOD FOR PROTEIN EXPRESSION AND MANUFACTURING, AND KIT USING THE SAME achieved
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a novel method for increasing an efficiency of the protein production in eukaryotic cells.
SOLUTION: In a method for expressing a target protein in eukaryotic cells, the transfer of a target mRNA from a nucleus to cytoplasm is promoted by performing at least one of the steps (A1) and (A2) described herein. By performing at least one of those steps, the transfer of the target mRNA, which is transcribed in a nucleus, to cytoplasm is promoted, and thus the expression of the target protein in cytoplasm is enhanced. The (A1) is a step of expressing a fusion RNA (X1), which includes the target mRNA and MS2 binding sequences, and a fusion protein (Y1), which includes the MS2 and the TAP, in the eukaryotic cells. The (A2) is a step of expressing a fusion RNA (X2), which includes the target mRNA and the RRE, and a protein (Y2), which includes the Rev, in the eukaryotic cells.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

医療分野等で利用される有用性の高いタンパク質の多くが、活性のために、糖鎖修飾やジスルフィド結合等の翻訳後修飾を必要としている。このため、工業的に前記有用タンパク質を生産するには、大腸菌等の微生物ではなく、真核細胞、特に動物細胞を宿主として利用し、組換えタンパク質として発現させる方法が一般的である。

しかしながら、真核細胞を宿主として使用した場合、微生物と比較して生産性が低いという問題がある。そこで、真核細胞による生産性を向上する方法として、転写を強力に誘導するプロモーターを使用して、mRNAの転写量を増加させる方法が報告されている。具体的には、前記プロモーターとして、サイトメガロウイルスのプロモーター(CMVプロモーター)および転写伸長因子1αのプロモーター等が利用されている(非特許文献1および2)。

しかしながら、このような改良によっても、動物細胞等の真核細胞におけるタンパク質の生産性は、十分とはいえず、さらなる改善が望まれている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、核内から細胞質へのターゲットmRNAの輸送を促進する方法、タンパク質の発現方法および製造方法、ならびに、それに用いるキットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
真核細胞において、核内から細胞質へのターゲットmRNAの輸送を促進する方法であって、
下記(A1)工程および下記(A2)工程の少なくとも一方の工程を有することを特徴とするmRNA輸送促進方法。
(A1)前記真核細胞において、前記ターゲットmRNAの3’側にMS2結合配列を有する融合RNA(X1)、および、MS2とTAPとを含む融合タンパク質(Y1)を発現させる工程であり、前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞である工程
(A2)前記真核細胞において、前記ターゲットmRNAの3’側にRREを有する融合RNA(X2)、および、Revを含むタンパク質(Y2)を発現させる工程であり、前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞である工程

【請求項2】
 
前記(A1)工程の前記融合RNA(X1)において、前記MS2結合配列の個数が、2個以上である、請求項1記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項3】
 
前記(A1)工程の前記融合RNA(X1)において、2個以上の前記MS2結合配列が連結している、請求項1または2記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項4】
 
前記(A1)工程において、前記真核細胞に、前記融合RNA(X1)を発現する核酸分子(x1)を導入して、前記融合RNA(X1)を発現させる、請求項1から3のいずれか一項に記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項5】
 
前記(A1)工程において、前記真核細胞が、前記融合タンパク質(Y1)を発現する形質転換体である、請求項4記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項6】
 
前記真核細胞に、前記融合タンパク質(Y1)を発現する核酸分子(y1)を導入して、前記融合タンパク質を発現させる、請求項4記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項7】
 
前記MS2が、配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記TAPが、配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項1から6のいずれか一項に記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項8】
 
前記(A2)工程の前記タンパク質(Y2)が、Revを含む融合タンパク質である、請求項1記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項9】
 
前記(A2)工程において、前記真核細胞に、前記融合RNA(X2)を発現する核酸分子(x2)を導入して、前記融合RNA(X2)を発現させる、請求項1または8記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項10】
 
前記(A2)工程において、前記真核細胞が、前記タンパク質(Y2)を発現する形質転換体である、請求項9記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項11】
 
前記(A2)工程において、前記真核細胞に、前記タンパク質(Y2)を発現する核酸分子(y2)を導入して、前記タンパク質を発現させる、請求項9記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項12】
 
前記Revが、配列番号9のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項1および9から11のいずれか一項に記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項13】
 
前記真核細胞が、CHO細胞である、請求項1から12のいずれか一項に記載のmRNA輸送促進方法。

【請求項14】
 
真核細胞におけるターゲットタンパク質の発現方法であって、
前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞であり、
請求項1から13のいずれか一項に記載のmRNAの輸送促進方法によって、前記ターゲットタンパク質をコードするターゲットmRNAを細胞核から細胞質に輸送させ、前記細胞質において、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とするタンパク質の発現方法。

【請求項15】
 
真核細胞を用いたターゲットタンパク質の製造方法であって、
前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞であり、
請求項14記載の発現方法により、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とするタンパク質の製造方法。

【請求項16】
 
請求項1から13のいずれか一項に記載のターゲットmRNAの輸送促進方法に使用するキットであって、下記(a1’)および下記(a2’)の少なくとも一方を含むことを特徴とするmRNAの輸送促進用キット。
(a1’)ターゲットmRNAの3’側にMS2結合配列を有する融合RNA(X1)を発現する核酸分子(x1)、および、MS2とTAPとを含む融合タンパク質(Y1)を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体であり、前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞である組換え体
(a2’)ターゲットmRNAの3’側にRREを有する融合RNA(X2)を発現する核酸分子(x2)、および、Revを含むタンパク質(Y2)を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体であり、前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞である組換え体
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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