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GENOTYPE CLASSIFICATION METHOD FOR STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND PRIMER SET FOR USE IN THE SAME achieved

Patent code P140011111
Posted date Nov 12, 2014
Application number P2009-281486
Publication number P2011-120528A
Patent number P5083571
Date of filing Dec 11, 2009
Date of publication of application Jun 23, 2011
Date of registration Sep 14, 2012
Inventor
  • (In Japanese)鈴木 匡弘
Applicant
  • (In Japanese)愛知県
Title GENOTYPE CLASSIFICATION METHOD FOR STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND PRIMER SET FOR USE IN THE SAME achieved
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a genotype classification method for Staphylococcus aureus, which is obtained by improving a technique described in Publication NO.2006-141249 and is suitable for the actual industry (medical spot) and a primer set for use in the same.
SOLUTION: The genotype classification method for Staphylococcus aureus includes a step for detecting the presence/absence of (1) a phage-derived open reading frame (ORF), (2) an ORF derived from genomic islands except Staphylococcal cassette chromosome mec; SCCmec, (3) a transposon-derived ORF, (4) SCCmec-derived ORF, and (5) ORF constituting a genomic islet on the Staphylococcus aureus genome in an arbitrary order and performing genotype classification by combination of these ORF presence/absence.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(以下、MRSAという)は病院で数多く分離される病原菌である。東京都内のある病院(925床)では1ヶ月の間に72人の入院患者からMRSAが検出されたと報告されており、また熊本県内のある病院(550床)では同じく1ヶ月の間に35人の入院患者からMRSAが検出されたと報告されている。

厚生労働省の感染症発生動向調査では、全国の主要な約500病院からの報告だけで、MRSA感染症は年間20,000件以上に及んでいる。

以上のことからMRSAは病院で非常に多く分離され、感染防止のための疫学調査が常に必要な病原菌であると考えられる。言い換えると、MRSAは院内感染原因菌として重要な菌である。院内感染を減少させるためには感染ルートの特定が必要である。

院内感染が疑われる場合には、感染ルートを特定するために、異なる患者から分離された菌株が同一か否かを判定する必要がある。そのために菌株が保有するゲノムの特徴を検出し菌株を特定するが、これを遺伝子型別分類という。

菌の遺伝子型別分類の方法としては、従来、パルスフィールドゲル電気泳動法(以下、PFGEという。)が多用されている。PFGEは菌のゲノムDNAを制限酵素で切断し、その断片の電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、識別能力が高く、再現性があることから遺伝子型別分類の定法とされている。

しかし、PFGEは結果が出るまでに早くても菌株分離同定後3日程度と時間がかかり、検査結果が出たときにはすでに感染拡大が終了していることが多い。それに加え、複雑なバンドパターンにより判定するため、主観的な要素が入りがちで、同時に泳動した菌株間以外で遺伝子型が同一か否かを判断することは困難である。したがって、時間的あるいは距離的に隔たりのある(異なる時または別の場所で行った)PFGE解析結果間での遺伝子型の比較は実質上不可能であった。

さらに、PFGEは作業が煩雑で作業者の熟練を要するうえ、パルスフィールドゲル電気泳動装置などの特殊な装置を必要とし、コストが高い。

そこで、これらのPFGEの欠点を克服した方法として、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の特定のORFの有無を検出することによる遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが開発されている(特許文献1参照)。特許文献1に記載の技術によって、PFGEと同等な精度の結果を3時間程度で得られ、かつ客観的な遺伝子型別分類が可能となった。

しかし、特許文献1に記載の技術では、1株を解析するためにPCRチューブが4本必要である([0062]等参照)。PCRに用いるプライマーの中に、異なるプライマーが互いに結合して二量体を形成してしまうことがあるため、このように4本のPCRチューブが必要になる。

このため、前記技術では一度のPCR反応で解析できるMRSAの株数が少なく、それゆえ解析の手間やゲルなども余分にかかるため、まだコストを充分低くすることができていない。

さらに、菌株識別に特化しているため、メチシリン耐性株と感受性株の区別ができず、特許文献1に記載の遺伝子型別分類法を実施するためには、あらかじめ別の試験(薬剤感受性試験など)によって黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性であるかどうかを判定しておかなければならない。

また、特許文献1の表3を見れば分かるように、特許文献1に記載の技術は、SCCmecタイプがType IIである、日本の病院でもっとも多数分離されるNewYork/Japan cloneと言われるMRSAをきれいに分類することを目的として考案されたものであると考えられる。このため特許文献1に記載の技術は、NewYork/Japan clone以外のMRSAやメチシリン感受性の黄色ブドウ球菌については、菌株識別能力が劣る。

さらに、特許文献1に記載の技術では、テンプレートの調整時における菌の懸濁量によりバンドが薄くなったり、全くバンドが現れなくなったりする事があるという問題がある。そのため、特許文献1に記載の技術はPCRに用いるプライマーの配列の最適化が不十分であり、感度が十分ではないと推定され、正確に判定するためにはテンプレートDNA濃度を適度な範囲に納める必要がある。

このような理由から、特許文献1に記載の技術は、実施するためにある程度の熟練を要するものである。

したがって、より簡便かつ迅速に、幅広く黄色ブドウ球菌を遺伝子型別分類することができる方法の開発が依然として強く望まれている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法(菌株特定法)およびこれに用いるプライマーセットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
日本で分離され、同定された黄色ブドウ球菌の菌株のゲノム上の、
(1)ファージ由来遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)、
(2)ブドウ球菌カセット染色体(Staphylococcal cassette chromosome mec; SCCmec)以外のゲノミックアイランド由来のORF、
(3)トランスポゾン由来のORF、
(4)SCCmec由来のORF、および
(5)genomic isletを構成するORF
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを有する黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法であって
上記(1)のORFにおける遺伝子が、SAV0850、SAV0898、SAV0866、SA1774、SAV1974、SAV0855、SAV0881、SLTorf175、SA1801、SAV0913、SLTorf182、SAV1998およびPV83orf2からなる群から選ばれる少なくとも11種の遺伝子であり、
上記(2)のORFにおけるゲノミックアイランドが、Mu50株のSaGImであり、
上記(3)のORFにおけるトランスポゾンが、トランスポゾンTn554であり、
上記(4)のORFにおける遺伝子が、mecA、mec gene complex class B、SCCmec kdpCおよびcassette chromosome recombinase A2であり、
上記(5)のORFにおけるgenomic isletが、MW2株(GenBank Accession Number BA000033)のMW0919およびN315株(GenBank Accession Number BA000018)のSA2259であり、
上記検出が、上記ORF群に対応するプライマーの組を用いて、PCR(polymerase chain reaction)法により上記ORFの検出を行う
ことを特徴とする黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法

【請求項2】
 
上記(1)のORFにおける遺伝子が、SAV0850、SAV0898、SAV0866、SA1774、SAV1974、SAV0855、SAV0881、SLTorf175、SA1801、SAV0913、SLTorf182、SAV1998およびPV83orf2であることを特徴とする請求項1に記載の黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法。

【請求項3】
 
配列表の配列番号11と12、13と14、15と16、17と18、19と20、21と22、33と34、35と36、37と38、39と40、41と42、43と44、45と46に示された13組の塩基配列の組み合わせからなる13組のプライマーを用いて、PCR(polymerase chain reaction)法により前記(1)のORFの検出を行い、
配列表の配列番号23および24に示された塩基配列の組み合わせからなる1組のプライマーを用いて、PCR法により前記(2)のORFの検出を行い、
配列表の配列番号9および10に示された塩基配列の組み合わせからなる1組のプライマーを用いて、PCR法により前記(3)のORFの検出を行い、
配列表の配列番号3と4、5と6、7と8、25と26、31と32に示された塩基配列の組み合わせからなる5組のプライマーを用いて、PCR法により前記(4)のORFの検出を行い、
配列表の配列番号27と28、29と30に示された2組の塩基配列の組み合わせからなる2組のプライマーを用いて、PCR法により前記(5)のORFの検出を行い、
上記プライマーには、2塩基以下の付加、置換、欠失、挿入が有ってもよいことを特徴とする請求項1または2に記載の黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法。

【請求項4】
 
前記プライマーに付加、置換、欠失、挿入がないことを特徴とする請求項3に記載の黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法。

【請求項5】
 
前記PCR法がマルチプレックスPCR法であることを特徴とする請求項14のいずれかに記載の黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法。

【請求項6】
 
前記(1)~(5)のORF有無の検出結果を、それぞれ1(有)と0(無)に置き換えて2進法コード化することを特徴とする請求項1~5のいずれかに記載の黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法。

【請求項7】
 
前記(4)および(5)のORF有無の検出結果を一つにまとめて2進法コード化することを特徴とする請求項6に記載の黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法。

【請求項8】
 
前記2進法コード化した結果をさらに10進法コード化することを特徴とする請求項6または7に記載の黄色ブドウ球菌の遺伝子型分類法。

【請求項9】
 
配列表の配列番号11と12、13と14、15と16、17と18、19と20、21と22、33と34、35と36、37と38、39と40、41と42、43と44、45と46に示された塩基配列の組み合わせからなる13組のプライマーと、
配列表の配列番号23および24に示された塩基配列の組み合わせからなる1組のプライマーと、
配列表の配列番号9および10に示された塩基配列の組み合わせからなる1組のプライマーと、
配列表の配列番号3と4、5と6、7と8、25と26、31と32に示された塩基配列の組み合わせからなる5組のプライマーと、
配列表の配列番号27と28、29と30に示された塩基配列の組み合わせからなる2組のプライマーと
を含むことを特徴とする黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類用プライマーセットであって、
上記プライマーには、2塩基以下の付加、置換、欠失、挿入が有ってもよい黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類用プライマーセット。

【請求項10】
 
前記プライマーに付加、置換、欠失、挿入がないことを特徴とする請求項9に記載のプライマーセット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) (In Japanese)黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセット
(In Japanese)手続き等について、詳しくお知りになりたい方は「問合せ先」まで直接お問い合わせください。


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