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ASSAY FOR UBIQUITINATION OF PINK1 AND SCREENING USING THE SAME meetings

Patent code P150011312
File No. S2012-0927-N0
Posted date Feb 16, 2015
Application number P2012-165160
Publication number P2014-025764A
Patent number P6024953
Date of filing Jul 25, 2012
Date of publication of application Feb 6, 2014
Date of registration Oct 21, 2016
Inventor
  • (In Japanese)許 南浩
  • (In Japanese)村田 等
  • (In Japanese)阪口 政清
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人岡山大学
Title ASSAY FOR UBIQUITINATION OF PINK1 AND SCREENING USING THE SAME meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an assay method for detecting ubiquitination of PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1) and a method for screening proteins and compounds which exacerbate ubiquitination of PINK1, by using the assay method.
SOLUTION: The assay method for detecting ubiquitination of PINK1 includes bringing PINK1, ubiquitin, SARM1α, and TRAF2 and/or TRAF6 into contact with each other under the existence of an ubiquitin activating enzyme (E1), ubiquitin binding enzyme (E2), and ATP to detect production of a complex of PINK1, ubiquitin, SARM1α, and TRAF2 and/or TRAF6.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

パーキンソン病は中脳のドーパミン分泌細胞の変性を主な原因とする神経変性疾患である。この神経細胞変性の1つの原因として、ミトコンドリアの機能不全(不要ミトコンドリアの蓄積)が挙げられる。細胞内で不要になったミトコンドリアの除去には、パーキンソン病原因遺伝子の1つでユビキチンE3リガーゼであるParkinが働く(非特許文献1を参照)。Parkinによる不要ミトコンドリア除去には、ミトコンドリア膜上へのPTEN-induced putative kinase 1(PINK1)の蓄積が必要である(非特許文献2及び3を参照)。しかし、PINK1の蓄積(安定化)のメカニズムはこれまで明らかとなっていなかった。

PINK1は主にミトコンドリアに局在するセリン・スレオニンキナーゼで、PINK1の変異はパーキンソン病発症に関わっていることが報告されている(非特許文献4を参照)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、パーキンソン病等の疾患に関与するPINK1のユビキチン化を検出する方法及び該方法を用いたPINK1が関与する疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6とをユビキチン活性化酵素(E1)及びユビキチン結合酵素(E2)並びにATPの存在下で接触させ、PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6との複合体形成を検出することを含む、PINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項2】
 
in vitroで行う、請求項1記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項3】
 
プルダウンアッセイを用いて行う、請求項1又は2に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項4】
 
ペプチドタグと融合したPINK1、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6とをユビキチン活性化酵素(E1)及びユビキチン結合酵素(E2)並びにATPの存在下で、in vitroで反応させ複合体を形成させ、PINK1と融合したエピトープと特異的に結合する化合物を結合させた担体を用いて複合体を回収したのち、抗ユビキチン抗体を用いて複合体中のユビキチンを検出することにより、PINK1がユビキチンと結合しユビキチン化したかどうかを検出する、請求項3記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項5】
 
SARM1αが第1~106番目のアミノ酸配列からなるドメインを含む、SARM1αの断片である、請求項1~4のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項6】
 
ユビキチン結合酵素(E2)がUbcH13/Uev1aである、請求項1~5のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項7】
 
in vivoで行う、請求項1記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項8】
 
培養細胞中でPINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)並びにユビキチン結合酵素(E2)を発現させることを含む、請求項7記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項9】
 
SARM1αが第1~106番目のアミノ酸配列からなるドメインを含む、SARM1αの断片である、請求項7又は8に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項10】
 
ユビキチン結合酵素(E2)がUbcH13/Uev1aである、請求項7~9のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項11】
 
請求項1~10のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法を用いて、パーキンソン病の予防又は治療に用い得る薬剤をスクリーニングする方法であって、請求項1~10のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法において、候補薬剤を添加し、候補薬剤の添加によりPINK1のユビキチン化が促進されたかどうかを測定し、候補薬剤の添加によりPINK1のユビキチン化が促進された場合に、候補薬剤がパーキンソン病の予防又は治療に用い得ると評価する、スクリーニング方法。

【請求項12】
 
PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2)並びにATPを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法でPINK1のユビキチン化を検出するためのキット。

【請求項13】
 
PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)並びにユビキチン結合酵素(E2)をコードするDNAを含む、請求項7~10のいずれか1項に記載の方法でPINK1のユビキチン化を検出するためのキット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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技術移転に関しては岡山TLOが窓口になります。


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