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TARGET CELL SEPARATION METHOD AND TARGET CELL SEPARATION APPARATUS

Patent code P150011320
File No. S2013-0111-N0
Posted date Feb 18, 2015
Application number P2012-234653
Publication number P2014-083000A
Patent number P6198186
Date of filing Oct 24, 2012
Date of publication of application May 12, 2014
Date of registration Sep 1, 2017
Inventor
  • (In Japanese)藤井 輝夫
  • (In Japanese)金田 祥平
  • (In Japanese)荒木 文子
Applicant
  • (In Japanese)一般財団法人生産技術研究奨励会
Title TARGET CELL SEPARATION METHOD AND TARGET CELL SEPARATION APPARATUS
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a target cell separation method and a target cell separation apparatus capable of separating target cells from a solution containing contaminants, with the sizes and affinity of the target cells taken into consideration and to make it possible to analyze and culture the target cells after separation.
SOLUTION: A target cell separation apparatus has a modification surface 2 of a biopolymer 2A which binds specifically to a protein expressed specifically on the surface of a target cell, formed on a microfilter 3 having a filtering size smaller than the diameter of the target cell 5 and on a surface of a substrate 1 constituting a part of the microfilter. A target cell separation method introduces a solution with the target cell and a non-target cell 5' to form a contaminant suspended therein to the target cell separation apparatus, causes the target cells 4, 4' having the specifically expressed protein on the surface thereof to act on the biopolymer 2A on the modification surface so that the target cells are captured on the modification surface of the substrate, thereby separating the target cells having the specifically expressed protein on the surface thereof from the non-target cells.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

従来の夾雑物を含む溶液からの細胞分離法としては、目的細胞表面に特異的に発現しているたんぱく質と結合する抗体を用いるもの(イムノアフィニティ)が主流である。具体的には蛍光修飾抗体を用いて染色した細胞を含む懸濁液を微小流路内に導入し、レーザーを用いて細胞の蛍光強度を解析し、強度に応じて細胞を分離・分取するFACS(Fluorescent Activated Cell Sorting)や抗体修飾磁気粒子とその細胞懸濁液を混合し、磁気粒子に補足された目的細胞だけを磁力によって分離するMACS(Magnetic Activated Cell Sorting)と呼ばれる分離技術が開発され、その装置が市販されている。市販されている装置以外では、抗体修飾したマイクロポスト構造を内部に持つ微小流路を利用したアフィニティ分離(下記非特許文献1参照)や細胞のサイズを用いた分離も行われている(下記非特許文献2参照)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、目的細胞の分離方法に関するものであり、特に、夾雑物を含む溶液から目的細胞を分離し、分離後の細胞を解析および培養する技術に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
(a)目的細胞4および5の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルター3と、該マイクロフィルター3の一部を構成する基板1表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面2とを形成し、
(b)そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞4,4´および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞5´が懸濁された溶液6を導入し、
(c)前記修飾表面2の生体高分子2Aと前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞4,4´の表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、
(d)前記マイクロフィルター3の下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加させて、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルター3のフィルタリングサイズより小さい非目的細胞5´を除去・回収することで、前記非目的細胞5´と前記目的細胞4,4´,5を分離し、
(e)さらにリンス液7を導入し、
(f)前記リンス液7を攪拌する操作を行い、前記マイクロフィルター3のフィルタリングサイズより大きい目的細胞5を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞5を分離することを可能とし、
(g)前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞4,4´のみを前記基板1の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞4,4´を前記非目的細胞5´から分離することを特徴とする目的細胞の分離方法。

【請求項2】
 
請求項1記載の目的細胞の分離方法において、細胞剥離液8を用いて前記修飾表面2上から前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞4,4´を離脱させ、その後に、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞4,4´をサイズ毎に回収することを特徴とする目的細胞の分離方法。

【請求項3】
 
(a)目的細胞14,15の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターとしての微細構造を有する貫通穴フィルター12を構成する基板11表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面13とを形成し、
(b)そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞14,14´および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞15と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞15´が懸濁された溶液16を導入し、
(c)前記修飾表面13の生体高分子13Aと前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞14,14´の表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、
(d)続いて前記貫通穴フィルター12の下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記貫通穴フィルター12のサイズより小さい非目的細胞15´を除去・回収し、
(e)さらにリンス液17を導入し、
(f)前記リンス液17を攪拌する操作を行い、前記貫通穴フィルター12のフィルタリングサイズより大きい目的細胞15を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞15を分離することを可能とし、
(g)前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞14,14´のみを前記基板11の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞14,14´を前記非目的細胞15´から分離することを特徴とする目的細胞の分離方法。

【請求項4】
 
請求項3記載の目的細胞の分離方法において、細胞剥離液18を用いて前記基板11の修飾表面上から前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞14,14´を離脱させ、その後に、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞14,14´をサイズ毎に回収することを特徴とする目的細胞の分離方法。

【請求項5】
 
請求項1又は3記載の目的細胞の分離方法において、前記生体高分子2A,13Aが抗体、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーであることを特徴とする目的細胞の分離方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2012234653thum.jpg
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