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METHOD FOR PURIFYING STEROID HORMONE MEMBRANE RECEPTORS

Patent code P150011504
File No. S2013-1110-N0
Posted date Mar 6, 2015
Application number P2013-136980
Publication number P2015-010064A
Patent number P6516956
Date of filing Jun 28, 2013
Date of publication of application Jan 19, 2015
Date of registration Apr 26, 2019
Inventor
  • (In Japanese)徳元 俊伸
  • (In Japanese)大島 卓之
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人静岡大学
Title METHOD FOR PURIFYING STEROID HORMONE MEMBRANE RECEPTORS
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simple method for screening substances that target a steroid membrane receptor, more specifically, to provide a method for purifying steroid membrane receptor having steroid hormone-binding activity.
SOLUTION: Provided is a method for purifying a steroid membrane receptor comprising the steps of: introducing a gene encoding a steroid membrane receptor into a cell for expression of the receptor to obtain a recombinant cell; recovering a membrane fraction containing the steroid membrane receptor; and purifying the steroid membrane receptor.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

ステロイドホルモンの一種である17α,20β-dihydroxy-4-prognen-3-one(17,20β-DHP)は、魚類の卵成熟誘起ホルモンとして知られている。膜受容体を介した魚類の卵成熟誘導機構に関する研究において、ステロイド膜受容体の候補であるプロゲスチン膜受容体(membrane progestin receptor;mPR)が発見され、脳や腎臓等様々な組織で発現していることが明らかになった(非特許文献1及び2)。

mPRは、7回膜貫通型受容体であり、脊髄動物細胞に保存されている、AdipoQ受容体と相同性を示す11遺伝子からなる新規Gタンパク質共役受容体ファミリーを形成し、progestin and adipoQ receptors(PAQR)ファミリーと命名されている。mPR分子はα、β、γ、δ、及びεの5種類を有し、それぞれPAQR7、8、5、6及び9に対応する(非特許文献3及び4)。

化学物質とステロイド膜受容体との相互作用の検討は、創薬研究において重要なアプローチとなっている。現状このような創薬研究は、膜受容体遺伝子を導入した培養細胞又はその細胞膜画分を用いた技術によって評価されている。ステロイド膜受容体に作用する薬物候補のスクリーニングは、生細胞を用いるためホルモン刺激による生体反応を検定できるとのメリットがある。同時に、培養細胞におけるステロイド膜受容体の発現量が低いことや、ラジオアイソトープの使用、細胞膜画分の都度調製の必要があることなどのデメリットがある。また、細胞培養のコストが高いため、多検体をスクリーニングするための実用化は困難と考えられる。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、ステロイドホルモン膜受容体の精製方法、特に遺伝子組み換え細胞において発現されたステロイドホルモン膜受容体の精製方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ステロイド膜受容体を発現できるように、ステロイド膜受容体をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、遺伝子組換え細胞を得る工程と、
遺伝子組換え細胞を培養し、ステロイド膜受容体を発現させる工程と、
ステロイド膜受容体を含む膜画分を回収し、ステロイド膜受容体を精製する工程と
を含み、
前記ステロイド膜受容体が、プロゲスチン膜受容体(mPR)であり、
前記精製工程が、タグを利用したアフィニティークロマトグラフィー、及びアミノ基が付加されたセルロースゲルによって行われ、前記アミノ基が付加されたセルロースゲルを用いる際、mPRを含むサンプルを前記アミノ基が付加されたセルロースゲルに吸着させた後に、溶出バッファーでmPRを溶出し、回収することによって精製する、
ステロイド膜受容体の精製方法。

【請求項2】
 
前記ステロイド膜受容体が、プロゲスチン膜受容体(mPR)α、β、γ、δ、又はεである、請求項1に記載の精製方法。

【請求項3】
 
前記宿主細胞が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項1又は2に記載の精製方法。

【請求項4】
 
前記タグを利用したアフィニティークロマトグラフィーが、Hisタグ、c-Mycタグ、GSTタグ、MBPタグ、FLAGタグ、HQタグ、HNタグ、HATタグ及びV5タグから選択されるタグを利用したものである、請求項1~3のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項5】
 
前記タグを利用したアフィニティークロマトグラフィーが、Hisタグ及びc-Mycタグを利用したものである、請求項4に記載の精製方法。

【請求項6】
 
前記精製工程が、Hisタグを利用したアフィニティークロマトグラフィー、アミノ基が付加されたセルロースゲルによる精製、及び、c-Mycタグを利用したアフィニティークロマトグラフィーの順に行われる、請求項5に記載の精製方法。

【請求項7】
 
前記アミノ基が付加されたセルロースゲルが、セルファイン(登録商標)アミノである、請求項1~6のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項8】
 
前記セルファイン(登録商標)アミノが、リガンドが固定されることなく精製に使用される、請求項7に記載の精製方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2013136980thum.jpg
State of application right Registered
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