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METHOD OF HIGH EFFICIENTLY PREPARING SPECIFIC ANTIBODY CAPABLE OF QUICKLY DIAGNOSING MICROORGANISMS meetings

Patent code P150011535
Posted date Mar 19, 2015
Application number P2013-209093
Publication number P2014-087334A
Patent number P6311959
Date of filing Oct 4, 2013
Date of publication of application May 15, 2014
Date of registration Mar 30, 2018
Priority data
  • P2012-222032 (Oct 4, 2012) JP
Inventor
  • (In Japanese)冨田 昌弘
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人三重大学
Title METHOD OF HIGH EFFICIENTLY PREPARING SPECIFIC ANTIBODY CAPABLE OF QUICKLY DIAGNOSING MICROORGANISMS meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of high efficiently preparing a specific antibody capable of quickly diagnosing microorganisms.
SOLUTION: A preparation method of hybridoma comprises: 1) an immune step of repeatedly administering an antigen derived from microorganisms to living matter, and expressing an antigen-specific receptor on the surface of B cell; 2) a step (1) of binding the antigen-specific receptor on the surface of B cell to a biotinylated antigen to prepare a complex of the B cell and the biotinylated antigen, and binding the complex to streptavidin to prepare a complex of the B cell, the biotinylated antigen, and streptavidin; 3) a step of binding myeloma cells and biotin to prepare the biotinylated myeloma cells; 4) a cell crosslinking step of obtaining B cells-myeloma cells by crosslinking with reaction of biotin and avidin; and 5) a hybridoma preparation step of obtaining hybridoma by applying electrical pulse of a direct-current and rectangular wave to the B cells-myeloma cells.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)



特定の抗原決定基だけと結合する抗体の集合体をモノクローナル抗体といい、B細胞とミエローマ細胞を融合して得られるハイブリドーマから獲得できる。従来、B細胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドーマを得る方法として、PEG法、HVJ法、パールチェイン法、レーザー法、B細胞ターゲティング法などが知られている(特許文献1~3を参照。なお、先行技術文献については、明細書の末尾に纏めて示した。)。このうち特許文献1には、2種類の細胞をPEG法、HVJ法等によって融合させることによって株化細胞を得る技術が、特許文献2には、交流と直流を組み合わせたパールチェイン法によってハイブリドーマを得る装置に関する技術が、特許文献3には、膜タンパク質の立体構造を認識する抗体を発現するハイブリドーマの作製方法に関する技術が、それぞれ開示されている。

しかしながらこれらの手法(特許文献1および2)は、目的抗体を発現するB細胞とミエローマ細胞との融合だけでなく、目的抗体を発現しないB細胞とミエローマ細胞との融合、B細胞同士の融合、ミエローマ細胞同士の融合等も起こるため、得られるハイブリドーマ中における目的ハイブリドーマの割合は数%程度であり、効率が悪かった。

この問題を解決する技術として、発明者は過去に、予め目的のB細胞とミエローマ細胞をビオチン/アビジンにより架橋させておき、電気パルスを処し目的のハイブリドーマを得る方法(次世代ハイブリドーマテクノロジー)を開発した(2001年の学会等にて発表済。)。当該手法は、抗原のB細胞ターゲッティングに基づいて、目的の高親和性・高特異性抗体産生B細胞を選択できる特徴があり、電気パルスを処す際にB細胞とミエローマ細胞を1:1の比率で選択融合を行なうことができる。このため、高効率で目的の高性能モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。





この手法を用いて、プレセニリン1(アルツハイマー病関連タンパク質)のペプチド配列に対する特異的モノクローナル抗体の作製に成功しているが、抗原として微生物(ウイルス、細菌等)をターゲットとしたモノクローナル抗体の高効率作製には成功していなかった。

一方、近年になって、インフルエンザ診断キットが普及しており、簡易なキットを用いて、A型とB型を区別することもできる。しかし、A型のなかでも亜型(H1N1亜型(ソ連型,新型),H3N2亜型(香港型),H5N1亜型(鳥インフルエンザ)等)まで区別することはできず、これらの亜型を調べるにはPCRを用いた再検査が必要となる。したがって、亜型を特定するまでには費用と時間がかかる。さらに現行の簡易キットでは、各亜型に対応した,投与すべき薬剤を適確に判断できない(なお、鳥インフルエンザのみを検出する抗体はすでに国内機関により開発済である。)。

Field of industrial application (In Japanese)



本発明は、微生物の迅速診断を可能とする特異抗体の高効率作製法等に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
下記工程を備えたことを特徴とするハイブリドーマ作製法であって、
1)生物に対して微生物由来抗原を繰り返し投与することにより、生体内の抗体産生B細胞の成熟度を促進し、B細胞表面に抗原特異的レセプターを発現させる免疫工程、
目的とする抗原を含まない共通抗原を添加することで、目的外のB細胞を取り除く不要B細胞ブロック工程、
2)上記B細胞表面に発現された抗原特異的レセプターとビオチン化抗原とを結合させて、B細胞-ビオチン化抗原複合体とした後、ストレプトアビジンを結合してB細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体を作製するB細胞修飾工程(1)、
3)ミエローマ細胞とビオチンとを結合してビオチン化ミエローマ細胞を作製するミエローマ修飾工程、
4)前記B細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体とビオチン化ミエローマ細胞とをビオチン-アビジン反応により架橋させてB細胞-ミエローマ細胞を得る細胞架橋工程、
5)B細胞-ミエローマ細胞に直流矩形波の電気パルスを負荷してハイブリドーマを得るハイブリドーマ作製工程
6)前記ハイブリドーマに限界希釈法を施して、クローン化するモノクローナル化工程において、
前記ビオチン化ミエローマ細胞の調製時には、NHS-biotin(N-hydroxysuccinimide-biotin)を用いてビオチン化したものであり、前記免疫工程において、アジュバントは、フロイントコンプリートアジュバント(CFA)またはフロイントインコンプリートアジュバント(IFA)であるハイブリドーマ作製法

【請求項2】
 
下記工程を備えたことを特徴とするハイブリドーマ作製法であって、
1)生物に対して微生物由来抗原を繰り返し投与することにより、生体内の抗体産生B細胞の成熟度を促進し、B細胞表面に抗原特異的レセプターを発現させる免疫工程、
目的とする抗原を含まない共通抗原を添加することで、目的外のB細胞を取り除く不要B細胞ブロック工程、
2')上記B細胞表面に発現された抗原特異的レセプターとストレプトアビジン化抗原とを結合させて、B細胞-抗原-ストレプトアビジン複合体を作製するB細胞修飾工程(2)、
3)ミエローマ細胞とビオチンとを結合してビオチン化ミエローマ細胞を作製するミエローマ修飾工程、
4')前記B細胞-ストレプトアビジン化抗原とビオチン化ミエローマ細胞とをビオチン-ストレプトアビジン反応により架橋させてB細胞-ミエローマ細胞を得る細胞架橋工程、
5)B細胞-ミエローマ細胞に直流矩形波の電気パルスを負荷してハイブリドーマを得るハイブリドーマ作製工程
6)前記ハイブリドーマに限界希釈法を施して、クローン化するモノクローナル化工程において、
前記免疫工程において、微生物由来抗原は、抗原ペプチドとタンパク質とを架橋剤であるSPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionateを用いて架橋したものであるハイブリドーマ作製法

【請求項3】
 
前記微生物由来抗原は、病原微生物、病原微生物の表面膜タンパク質、リケッチア、レプトスピラ及びインフルエンザウイルスの表面膜タンパク質からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項1または2に記載のハイブリドーマ作製法。

【請求項4】
 
前記インフルエンザウイルスは、新型(H1N1)、香港型及びソ連型からなる群から選択される少なくともいずれか一つであることを特徴とする請求項3に記載のハイブリドーマ作製法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2013209093thum.jpg
State of application right Registered
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