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(In Japanese)遺伝子ターゲティングベクター、その作製方法及び利用方法 meetings

Patent code P150011932
Posted date Apr 24, 2015
Application number P2013-518006
Patent number P5999602
Date of filing May 24, 2012
Date of registration Sep 9, 2016
International application number JP2012063248
International publication number WO2012165270
Date of international filing May 24, 2012
Date of international publication Dec 6, 2012
Priority data
  • P2011-118564 (May 27, 2011) JP
Inventor
  • (In Japanese)足立 典隆
Applicant
  • (In Japanese)公立大学法人横浜市立大学
Title (In Japanese)遺伝子ターゲティングベクター、その作製方法及び利用方法 meetings
Abstract (In Japanese)効率が高い遺伝子ターゲティングを可能とする遺伝子ターゲティングベクターを提供する。
バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が選択用マーカーの5’上流に存在することを特徴とする遺伝子ターゲティングベクター。標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が5’上流に存在する選択用マーカー及び標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片を連結することを含む、遺伝子ターゲティングベクターを作製する方法。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

細胞が備えている相同組換え能を利用して、ゲノム上の特定の遺伝子だけを破壊、ないし人為的に導入したDNA断片と置き換えることができる(非特許文献1、2)。これを遺伝子ターゲティングと呼ぶ。この手法は、個々の遺伝子機能解析に絶大な威力を発揮してきただけでなく、理想的な遺伝子治療法や品種改良法としても期待されている(非特許文献3)。しかし、一般的な高等動植物細胞における遺伝子ターゲティングの効率は極めて低く、改良法の開発が望まれている。プロモーターレス型(エクソントラップ型も含む。)のターゲティングベクターを用いることで効率の上昇が見込める(非特許文献4、5)が、汎用されているIRES配列では細胞内での発現レベルの低い遺伝子(プロモーター活性の弱い遺伝子)がトラップされにくいため、改良法の開発が求められていた。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、遺伝子ターゲティングベクター、その作製方法及び利用方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が5’上流に存在する選択用マーカー及び標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片を連結することを含む、遺伝子ターゲティングベクターを作製する方法であって、選択用マーカーはそのマーカー独自のプロモーターを持たないが、標的遺伝子とのバイシストロン性発現により発現がオンになり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES、IRES2及び2Aペプチド配列からなる群より選択される少なくとも1つである前記方法。

【請求項2】
 
標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片がスプライスアクセプター部位を含む請求項1記載の方法。

【請求項3】
 
標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片又は標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片がリニア化部位を含む請求項1又は2記載の方法。

【請求項4】
 
バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が選択用マーカーの5’上流に存在することを特徴とする遺伝子ターゲティングベクターであって、選択用マーカーはそのマーカー独自のプロモーターを持たないが、標的遺伝子とのバイシストロン性発現により発現がオンになり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES、IRES2及び2Aペプチド配列からなる群より選択される少なくとも1つである前記ベクター。

【請求項5】
 
選択用マーカーがポリA配列を持つが、プロモーターを持たない請求項4記載のベクター。

【請求項6】
 
選択用マーカーが部位特異的組換え酵素の標的配列で挟まれている請求項4又は5記載のベクター。

【請求項7】
 
さらにスプライスアクセプター部位が導入されている請求項4~6のいずれかに記載のベクター。

【請求項8】
 
さらにリニア化部位が導入されている請求項4~7のいずれかに記載のベクター。

【請求項9】
 
請求項4~8のいずれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターを用いて、細胞に遺伝子変異を導入することを含む、遺伝子ノックアウト細胞を作製する方法(in vivoのヒトでの方法を除外する)

【請求項10】
 
遺伝子ターゲティングベクターを作製するために使用する選択用マーカーを含んでいるベクターであって、選択用マーカーの5'上流にバイシストロン性発現を可能にするDNA配列が組み込まれ、かつ、選択用マーカーはそのマーカー独自のプロモーターを持たず、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES、IRES2及び2Aペプチド配列からなる群より選択される少なくとも1つである前記ベクター。

【請求項11】
 
さらにスプライスアクセプター部位が導入されている請求項10記載のベクター。

【請求項12】
 
選択用マーカーが、ピューロマイシン耐性遺伝子及び/又はハイグロマイシン耐性遺伝子であり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES配列及び/又は2Aペプチド配列である請求項1記載の方法。

【請求項13】
 
選択用マーカーが、ピューロマイシン耐性遺伝子及び/又はハイグロマイシン耐性遺伝子であり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES配列及び/又は2Aペプチド配列である請求項4記載のベクター。

【請求項14】
 
請求項13記載の遺伝子ターゲティングベクターを用いて、細胞に遺伝子変異を導入することを含む、遺伝子ノックアウト細胞を作製する方法(in vivoのヒトでの方法を除外する)
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2013518006thum.jpg
State of application right Registered
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