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(In Japanese)ルシフェラーゼの発光基質 meetings

Patent code P150012013
Posted date Jun 12, 2015
Application number P2013-530040
Patent number P6049019
Date of filing Aug 22, 2012
Date of registration Dec 2, 2016
International application number JP2012071207
International publication number WO2013027770
Date of international filing Aug 22, 2012
Date of international publication Feb 28, 2013
Priority data
  • P2011-182224 (Aug 24, 2011) JP
Inventor
  • (In Japanese)西山 繁
  • (In Japanese)斉藤 毅
  • (In Japanese)牧 昌次郎
  • (In Japanese)丹羽 治樹
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人電気通信大学
Title (In Japanese)ルシフェラーゼの発光基質 meetings
Abstract (In Japanese)
【課題】
  本発明は、ホタル生物発光系において、ルシフェラーゼによる発光活性を維持した修飾されたホタルルシフェリンおよびホタルルシフェリン類似体を提供することを目的とする。特に、本発明は、ホタル生物発光系における発光波長が、従来の発光基質と比較してより長波長側へシフトした新規発行基質を提供することを目的とする。
【解決手段】
  本発明は、ベンゾチアゾール環部分の7位が修飾されたルシフェリンを提供する。また、本発明は、ベンゼン環部分の6位が修飾されたルシフェリン類似体を提供する。さらに、本発明は、6-(ジアルキルアミノ)-2-ナフタレニル部分の5位が修飾されたルシフェリン類似体を提供する。
【選択図】
 図1
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

<ホタルルシフェリンについて>
近年、生物学的事象および現象の可視化が重要視され、可視化のための材料の拡大が望まれてきている。これに伴い、標識技術にも多様化が求められている。特に分子イメージングのための標識技術は、診断および検査機器の進歩と相まって大きく発展している。たとえば、癌や心疾患などに対する個別化医療などの先端技術に応用するための標識技術が精力的に研究されている。また、計測技術の進歩に伴い、より高感度および高性能な機器や標識材料に対する需要が急速に高まっている。

可視化技術の中で、ホタル生物発光系は、発光効率が非常に高く、最も効率よくエネルギーを光に変換することができる系といわれている。また、生物発光の分子機構解釈も進んでいる。

このホタル生物発光は、発光基質であるルシフェリンが発光酵素ルシフェラーゼの作用で化学反応することによって光を放出することが知られている。この反応では、発光基質が発光酵素内でアデノシン三リン酸(ATP)および2価のマグネシウムイオン(Mg2+)の存在下で、アデニリル化(AMP化)されて、活性型基質であるアデニリル体へと誘導される。次に、これが酸素化されてペルオキシドアニオンとなり、高エネルギー過酸化物であるジオキセタノンへと変換される。不安定なジオキセタノンは、分解しながらプロトンと二酸化炭素とを放出し、励起1重項状態となる。このジアニオン型励起1重項状態からの発光は、黄緑色であり、これがホタルの発光であるとされている。また、発光後の生成物は、オキシルシフェリンと称される。

上記のように、ホタル生物発光は、発光効率が非常に高く、また生物発光の分子機構の解明が進んでいるため、ホタル生物発光系を利用した多岐にわたる発光材料が多くの企業から販売されている。しかし、ホタル生物発光関連の発光材料開発は、医学生化学的分野を中心に実用化が進んでいるため、一般にタンパク質(酵素)側からの研究開発は盛んであるが、低分子化合物(基質)側からのアプローチは非常に少ない。特に、発光基質の骨格変換を行ったような構造と活性の相関研究はほとんど存在しない。

さらに、発光酵素は組換え技術によって安価に供給できるにもかかわらず、キット製品などで供給されているホタル生物発光系を応用した発光標識材料は安価ではない。これは、発光基質がルシフェリンであることに起因する。現在、天然の発光基質であるD体のルシフェリンは、非天然アミノ酸であるD-システインから合成されているが、D-システインは、非常に高価である。

<生物発光系を利用した長波長発光のニーズと状況>
多現象を観測するために、標識を利用した検出系においても、多色発光が求められている。このため、検出系に利用できる標識材料の波長域は、幅広い方が望ましい。たとえば、多色発光を利用した研究には、標識として450nm程度~650nm以上の波長、特に680nm以上において発光を有する標識材料が準備されることが望ましい。また、生体内深部標識における用途では、短波長光よりも長波長光のほうが優れた光透過性を有するという観点から、赤色発光標識材料が望まれている。特に、生体組織の光計測には、波長が650~900nmの近赤外光が使用されている。可視光(400~700nm)は、ヘモグロビンやそのほかの生体構成物質の吸収が大きく、また近赤外光よりも長い波長では、水の吸収が大きくなるため、生体内を光が進むことができない。これに対して近赤外線の波長の領域は生体を透過しやすいため、「生体の窓」とも呼ばれている。

上記のように、ホタル生物発光は、ルシフェリンとルシフェラーゼが化学反応することで生じる。これを利用して、たとえば、標的臓器にあらかじめ発光酵素をつくるように遺伝子組み換えを行っておき、その後に個体にルシフェリンを静注するか、腹腔内投与することによって全身に巡らせると、発光酵素を発現している標的臓器が発光する。また、標的臓器に癌を移植しておけば、癌の可視化、標的臓器が他生物の臓器であれば再生医療の基礎研究として利用することができる。特に、生体の窓領域に発光する長波長材料であれば、生体内透過性が高く、生体外から観測しやすくなると考えられる。

現在、ホタル生物発光系のための発光基質として入手可能なものには、いくつかの発光波長をもつ基質が存在する。これらの基質の最短および最長の両端の波長として、セレンテラジン系の青色(約480nm)とホタル系の赤色(約613nm)が挙げられる。また、鉄道虫発光酵素を利用した、より長波長の赤色発光材料(約630nm)が、最近市販されている。しかし、長波長光のほうが優れた光透過性を有することから、これらの発光波長だけでなく、発光波長の最長の波長のさらなる拡張には、潜在的需要が見込まれる。

生物発光系を利用した赤色と青色発光の既存製品の例を以下に示す:
1.プロメガ株式会社:Chroma-Luc:約613nm(非特許文献1)
この系は、ヒカリコメツキ虫(クリックビートル)の突然変異体および天然型ホタル発光基質を利用した系である。
2.東洋紡績株式会社:MultiReporter Assay System-Tripluc:約630nm(非特許文献2)
この系は、鉄道虫赤色発光酵素および天然型ホタル発光基質を利用した系である。緑色発光ルシフェラーゼ(SLG、最大発光波長550nm)、橙色発光ルシフェラーゼ(SLO、580nm)および赤色発光ルシフェラーゼ(SLR、630nm)の色のルシフェラーゼ遺伝子を使用して発光色を変化させている。これは、異なる発光色を与える発光酵素を利用している。
3.東京大学:アミノルシフェリン:約610nm(特許文献1)
これは、ルシフェリン誘導体を開示している。
4.プロメガ株式会社:Chroma-Luc: 約480nm(非特許文献3)
この系は、セレンテラジンおよびウミシイタケルシフェラーゼを利用した系である。
5.アトー株式会社:ウミホタル生物発光 約460nm(非特許文献4)
セレンテラジン系基質およびウミホタルルシフェラーゼを利用した系である。

また、本発明者らも、特許文献2において、ルシフェリン類似化合物を開示している。これらの化合物は、ルシフェリンと同様の骨格を有する化合物である。
さらに、本発明者らは、特許文献4において、ルシフェリンとは異なる骨格を有するルシフェリン類似化合物が、様々な発光波長を有することを開示している。これらのルシフェリン類似化合物においても、さらに発光波長を長波長側にシフトさせることが望まれる。

【特許文献1】
特開2007-091695号公報
【特許文献2】
国際公開公報第2007/116687号
【特許文献3】
特開2006-219381号公報
【特許文献4】
特開2010-215795号公報
【非特許文献1】
プロメガ株式会社総合カタログ2008-9 12.6
【非特許文献2】
Upload vol. 79, 2005 p 1-10, Toyobo Biochemicals for Lifescience 2006/2007 p4-67.
【非特許文献3】
プロメガ株式会社総合カタログ2008-9 12.14
【非特許文献4】
アトー株式会社総合カタログ2008-2009 p 247

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、ルシフェリン類似体に関する。より詳細には、本発明は、ルシフェラーゼによる発光波長が長波長側にシフトするよう修飾されたルシフェリン類似体に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の一般式を有する化合物またはその塩:
【化1】
 
(省略)
式中、
Zは、
【化2】
 
(省略)
であり、
R1は、HまたはC1-4アルキルであり、
R4は、OHまたはNH2であり、
nは、0、1、2または3である。

【請求項2】
 
R1は、Hであり、R4は、OHである、請求項1に記載の化合物またはその塩。

【請求項3】
 
Zは、
【化3】
 
(省略)
である、請求項2に記載の化合物またはその塩。

【請求項4】
 
Zは、
【化4】
 
(省略)
である、請求項2に記載の化合物またはその塩。

【請求項5】
 
Zは、
【化5】
 
(省略)
である、請求項1または2に記載の化合物またはその塩。

【請求項6】
 
Zは、
【化6】
 
(省略)
である、請求項2に記載の化合物またはその塩。

【請求項7】
 
Zは、
【化7】
 
(省略)
であり、nは、0である、請求項1または2に記載の化合物またはその塩。

【請求項8】
 
請求項1~7のいずれか1項に記載の化合物を含む、ルシフェラーゼの発光基質。

【請求項9】
 
請求項1~7のいずれか1項に記載の化合物を含む、発光検出キット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2013530040thum.jpg
State of application right Registered
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