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(In Japanese)DNA分子の環状化において単分子による環状化DNAのみを選別する方法

Patent code P150012018
Posted date Jun 12, 2015
Application number P2013-531289
Patent number P6066209
Date of filing Aug 24, 2012
Date of registration Jan 6, 2017
International application number JP2012071492
International publication number WO2013031700
Date of international filing Aug 24, 2012
Date of international publication Mar 7, 2013
Priority data
  • P2011-189280 (Aug 31, 2011) JP
Inventor
  • (In Japanese)水野 晋一
  • (In Japanese)小澤 秀俊
  • (In Japanese)長藤 宏司
  • (In Japanese)岡村 孝
Applicant
  • (In Japanese)学校法人久留米大学
Title (In Japanese)DNA分子の環状化において単分子による環状化DNAのみを選別する方法
Abstract (In Japanese)本発明は、単一のDNA分子により形成される環状DNA(単分子環状DNA)と、複数のDNA分子により形成される環状DNA(複数分子環状DNA)およびこれに由来する単分子環状DNAとを判別することを可能にする特定の構造を有する環状DNA分子の作成方法を提供する。本発明により、環状DNAの作成において複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することが可能となる。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

従来の遺伝子解析方法としてはベクター法が挙げられる。ベクター法では、解析対象遺伝子をベクターに組み込み、増殖させて得た遺伝子の全長の配列をシーケンサーにより決定する。しかし、ベクター法には培養操作が必要であるという問題がある他、シーケンサーで遺伝子の全長を解析する必要がある。

近年、遺伝子解析における、高速シーケンサーの開発がなされ、それに伴い遺伝子解析手段としてのメイトペア法が注目されている。

図1にメイトペア法による遺伝子解析の概略を模式的に示す。メイトペア法では、解析対象遺伝子の両末端に結合用塩基配列(制限酵素認識サイト)を結合させ、対象遺伝子を環状化する。そして、環状化された遺伝子を制限酵素認識サイトを中心に、通常TypeII制限酵素を用いて、その認識部位から前後の15塩基以上、好ましくは25塩基以上数十塩基以下で切り取り、これをPCRで増幅し、切り取られた部分遺伝子の塩基配列を決定する。これにより、対象遺伝子の両末端の配列が決定されると、既知の配列データを用いて遺伝子を特定することができる。メイトペアとは、1本のDNA断片の両端を解読した塩基配列の1組の配列データである。

一定塩基数の遺伝子を切り取る方法としては、TypeII制限酵素を用いて認識部位から離れた部位をカットすることで所定の塩基数を切り取る方法と、環状DNAをソニケーション(Sonication)等で物理的に裁断してリンカーにつけておいたビオチンで回収しその断片をPCRで増殖し配列を決定させる方法が実際に行われている。

即ち、メイトペア法では、DNAの両末端を結合させ、環状化した遺伝子において、結合部分の前後の一定の塩基配列を読み取ることによって、既知の遺伝子を特定することができる。基本的に遺伝子のヘッド部分とテイル部分の一部の塩基配列を読み取れば、その配列は遺伝子個々で確実に差別化出来るため、メイトペア法は、確実かつ簡便な遺伝子解析方法として採用されている(非特許文献1および2)。また、メイトペア法は、次世代のシーケンス解析に適用され、高速シーケンサーの登場により、ますます重要となってきている。

しかし、メイトペア法による遺伝子解析に供するためにDNAを環状化させる場合、単一の遺伝子、DNA(単一分子)による自己環状化以外に複数のDNA(複数分子)による環状化や複数分子(2分子以上)の直線的結合が起こる。複数分子による直線状分子は、その後の操作により環状分子と分離除去されるが、複数分子からなる環状分子は単分子からなる環状分子との分離はできず、夾雑物となる。複数分子環状物は下記に記載する理由により、個々の遺伝子解析を阻害し、分析特異性を大幅に低下させる。具体的には、図2に示すように3種類のcDNAを自己環状化させようとした場合、(B)に示すように、単分子DNAのみが環状化されている場合、メイトペア法により正確な配列によって遺伝子が特定できる。しかし、(B)のように単分子の環状化が起こる他、(C)のように環状化されない直線状のものが生じたり、(D)のように2つ乃至それ以上のcDNAでの環状化が生じたりしてしまう。(C)の場合はDNAエキソヌクレアーゼにより排除できるが、(D)のように複数cDNAが環状化されたものは環状化分子として認識され、排除することが出来ずメイトペア法遺伝子解析における夾雑物となる。

メイトペア法での遺伝子解析は、対象遺伝子の両末端塩基配列により遺伝子を特定するものである。具体的には、個々の遺伝子の両末端に環状化のための結合用アダプターを結合させ、両アダプター部位で遺伝子を結合環状化させた後、アダプター部位を中心に一定数の塩基配列となるように、切断し、この結果当初遺伝子のそれぞれの末端からの一部分の塩基配列を解析することで遺伝子を特定する。従って、複数分子による環状化物では、アダプター部位が複数あり、アダプターに結合する両端はそれぞれ、異なる遺伝子の一末端となる。遺伝子解析にあたっては、上記したように、前記した2方法のいずれかにより、アダプターを中心に結合する両端の一定数の塩基配列となるように環状化物を切断して遺伝子解析が行われる。従って、複数分子による環状化物より得られる、解析用の遺伝子断片は、異なる遺伝子のそれぞれの一末端を含むこととなり、一遺伝子の解析がなされない。このように、メイトペア法による遺伝子解析においては、複数分子による環状化物の存在は、各遺伝子解析を阻害することとなる。

複数DNA分子の環状化の確率は通常数%から十数%と方法によって差はあるが、既知の遺伝子の解析においては、異常な塩基配列として認識され、解析配列からの排除がほぼ可能である。そのため、煩雑さは生じるものの、若干精度が落ちるにすぎない。しかしながら、メイトペア法を、正常な遺伝子群のなかから融合遺伝子のような異常な遺伝子の存在の検出に用いる場合は、複数の正常な遺伝子が環状化した場合、あたかも異常遺伝子が存在すると判断されてしまう。その結果、正確に融合遺伝子などの異常遺伝子の存在を確認することが出来なくなってしまう。

融合遺伝子とは、複数(2個)の遺伝子が結合して、新規機能の遺伝子を構築したものである。例えば癌細胞では、欠損や重複、組換え、転座といった染色体構造の異常がみられる。DNAレベルでの遺伝子の分断とつなぎ合わせが起こり、それぞれの切断点に構造遺伝子が存在すると融合遺伝子が形成される。

通常、融合遺伝子は細胞にとって致死的であったり、無意味であったり、多くの場合は臨床的に問題になることはない。しかし融合遺伝子から産生される融合タンパク質が細胞増殖の調節を阻害することにより、細胞増殖が異常に促進される場合、臨床的にも腫瘍等として顕著化してくる。

融合遺伝子は、主に造血系腫瘍で発現されるといわれていたが、近年、上皮性固形腫瘍においても融合遺伝子の関与が推測されている(非特許文献3)。そのなかで、前立腺癌と肺癌から、責任融合遺伝子が発見された(非特許文献4および5)。

このことから、融合遺伝子の解析、即ち存在の確認は、腫瘍(癌)等の新規な診断方法として注目されている。具体的には、病態に対応することが知られている既知の融合遺伝子を検出することにより、迅速な病態の診断が可能となる。さらに、新規な融合遺伝子の発見は、創薬ターゲットの発見にもつながる。

一方、従来、固形腫瘍においては染色体分析に限界があり、融合遺伝子の解析・確認は極めて困難であったが、最近、ManoらによるcDNA機能的発現解析法など、新規な方法が開発されてきている。しかし、これらは操作の煩雑性、精度の問題等により、いまだに不十分な技術である(特許文献1)。また、最近、各種の遺伝子次世代高速シーケンサーが開発され、遺伝子の高速シーケンス解析が格段に進歩しており、短時間での解析が可能となりつつある。このことから、腫瘍ゲノム・遺伝子の高速・大量塩基配列解析による融合遺伝子の探索が始まっている(非特許文献6)。

メイトペア法を用いたシークエンス解析により融合遺伝子を同定するためには、単一のcDNA分子により形成される環状DNAを確実に得ることが必須である。融合遺伝子をメイトペア法により解析する場合の模式図を図3に示す。しかし、図4に示すように、複数のcDNAが1つの環状DNAを形成してしまう可能性があり、メイトペア法を用いたシークエンス解析を行うと、正常遺伝子であってもあたかも融合遺伝子であるような結果がでてしまう。これを従来の遺伝子配列にはないという理由から排除すれば、同様に融合遺伝子も排除されることとなってしまい、融合遺伝子の存在を確認することが実質的に不可能になってしまう。

メイトペア法で、融合遺伝子をそのシーケンス解析によって検出しようとする場合には、複数遺伝子による環状化cDNAの排除が必須である。

本発明者らはこれまでに、特定の構造を有するアダプターを用いて2段階のライゲーションを行うことにより、単一のDNA分子による環状化のみを起こし、複数のDNA分子による多分子間での環状化を起こさせない方法を見いだしている(未公表)。しかし、当該方法によっても、複数のDNA分子による環状化を完全に阻止し、複数のDNA分子により形成される環状DNAを100%排除することは不可能であった。メイトペア法を用いた解析、特に、新規融合遺伝子の探索を目的とする解析においては、複数遺伝子による環状化DNAがごく僅かに存在するだけでも擬陽性クローンとなり得るため、問題である。

したがって、複数のDNA分子により形成される環状DNAを完全に排除し、単一のDNA分子により形成される環状DNAのみを確実に得る方法が求められている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、単一のDNA分子により形成される環状DNAと、複数のDNA分子により形成される環状DNAおよびこれに由来する環状DNAとを判別可能な構造を有する環状DNA分子の作成方法、単一のDNA分子により形成される環状DNAのみを選別する方法、かかる方法に使用される新規アダプターおよび該新規アダプターを含む環状DNA作成用キットに関する。更には、本発明は、上記の方法により得られる環状DNAを用いた、遺伝子の同定及び/または検出方法に関する。とりわけ、種々の病態を引き起こす融合遺伝子の同定及び/または検出方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の工程を含む、環状DNA分子の集団の作成方法であって、該方法により作成された環状DNA分子の集団から複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することを可能にする方法:
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
アダプター(b)は、該アダプター(b)ごとに異なる固有配列を2つ含み、該2つの固有配列は同一方向または逆方向に配向した同一の配列であり; かつ、
アダプター(b)は、該2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含み、該切断部位は、アダプター(A)の切断部位を切断する際には切断されることがなく、かつ、アダプター(A)の切断末端とは結合しない切断末端を生じさせるものである;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程;
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において環状化せず直線状となったDNA分子を除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程; および、
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程、
ここで、工程6)で得られる環状DNA分子は、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAであると判定されるものである。

【請求項2】
 
アダプター(b)が、2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じる切断部位を2つ含むものである、請求項1記載の方法。

【請求項3】
 
アダプター(A)が、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む互いに相補的な二本鎖DNAであり、
アダプター(B)が、下記構造Z1-Y-Z2-AまたはZ1-Y-Z’2-Aを有する互いに相補的な二本鎖DNAである、請求項1または2記載の方法:
【化1】
 
(省略)
[構造中、
Aは、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであって、アダプター(A)に相当し;
Z1-Y-Z2は、請求項1または2におけるアダプター(b)に相当し;
Yは、パリンドローム型制限酵素サイトy1およびy2を含む二本鎖DNAであり;
y1およびy2は同一であり、Xとは異なる配列を有し、かつ、Xの切断により生じる切断末端と相補的でない切断末端を生じさせるものであり;
Z1およびZ2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC2は、互いに逆方向に配向した同一の配列であり;
nは1以上40以下の整数であり;
N1~Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり;
N’1~N’nは、前記N1~Nnに対してそれぞれ下記:
【表1】
 
(省略)
のデオキシリボヌクレオチドであり、ここで、kは1~nの整数である]

または

【化2】
 
(省略)
[構造中、
Z1-Y-Z’2は、請求項1または2におけるアダプター(b)に相当し;
Z1およびZ’2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC’2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC’2は、同一方向に配向した同一の配列であり;
A、X、Y、y1、y2、n、N1~Nn、N’1~N’n、およびkの定義は、上記の構造Z1-Y-Z2-Aにおけるものと同一である]。

【請求項4】
 
請求項1~3いずれかに記載の方法によって作成された環状DNA分子の集団。

【請求項5】
 
以下の工程を含む、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAの作成方法:
1)請求項1~3のいずれかに記載の方法によって環状DNA分子を作成する工程;および
2)該作成された環状DNA分子についてアダプター(b)部分の配列を配列決定し、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程、ここで、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAである。

【請求項6】
 
請求項5記載の方法によって作成された、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNA。

【請求項7】
 
以下の工程を含む、環状DNA分子の作成において、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する方法:
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
アダプター(b)は、該アダプター(b)ごとに異なる固有配列を2つ含み、該2つの固有配列は同一方向または逆方向に配向した同一の配列であり; かつ、
アダプター(b)は、該2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含み、該切断部位は、アダプター(A)の切断部位を切断する際には切断されることがなく、かつ、アダプター(A)の切断末端とは結合しない切断末端を生じさせるものである;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程;
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において環状化せず直線状となったDNA分子を除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程;
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程;および、
7)工程6)で得られた環状DNA分子が有するアダプター(b)部分の配列を配列決定し、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程、ここで、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAである。

【請求項8】
 
アダプター(b)が、2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じる切断部位を2つ含むものである、請求項7記載の方法。

【請求項9】
 
アダプター(A)が、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む互いに相補的な二本鎖DNAであり、
アダプター(B)が、下記構造Z1-Y-Z2-AまたはZ1-Y-Z’2-Aを有する互いに相補的な二本鎖DNAである、請求項7または8記載の方法:
【化3】
 
(省略)
[構造中、
Aは、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであって、アダプター(A)に相当し;
Z1-Y-Z2は、請求項7または8におけるアダプター(b)に相当し;
Yは、パリンドローム型制限酵素サイトy1およびy2を含む二本鎖DNAであり;
y1およびy2は同一であり、Xとは異なる配列を有し、かつ、Xの切断により生じる切断末端と相補的でない切断末端を生じさせるものであり;
Z1およびZ2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC2は、互いに逆方向に配向した同一の配列であり;
nは1以上40以下の整数であり;
N1~Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり;
N’1~N’nは、前記N1~Nnに対してそれぞれ下記:
【表2】
 
(省略)
のデオキシリボヌクレオチドであり、ここで、kは1~nの整数である]

または

【化4】
 
(省略)
[構造中、
Z1-Y-Z’2は、請求項7または8におけるアダプター(b)に相当し;
Z1およびZ’2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC’2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC’2は、同一方向に配向した同一の配列であり;
A、X、Y、y1、y2、n、N1~Nn、N’1~N’n、およびkの定義は、上記の構造Z1-Y-Z2-Aにおけるものと同一である]。

【請求項10】
 
請求項7~9いずれかに記載の方法により選別された、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNA。

【請求項11】
 
下記構造Z1-Y-Z2-AまたはZ1-Y-Z’2-Aを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる環状DNA作成用アダプターであって、該アダプターを用いて作成された環状DNA分子の集団から複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することを可能にするための、アダプター:
【化5】
 
(省略)
[構造中、
Aは、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであり;
Yは、パリンドローム型制限酵素サイトy1およびy2を含む二本鎖DNAであり;
y1およびy2は同一であり、Xとは異なる配列を有し、かつ、Xの切断により生じる切断末端と相補的でない切断末端を生じさせるものであり;
Z1およびZ2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC2は、互いに逆向きに配向した同一の配列であり;
nは1以上40以下の整数であり;
N1~Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり;
N’1~N’nは、前記N1~Nnに対してそれぞれ下記:
【表3】
 
(省略)
のデオキシリボヌクレオチドであり、ここで、kは1~nの整数である]

または

【化6】
 
(省略)
[構造中、
Z1およびZ’2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC’2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC’2は、同一方向に配向した同一の配列であり;
A、X、Y、y1、y2、n、N1~Nn、N’1~N’n、およびkの定義は、上記の構造Z1-Y-Z2-Aにおけるものと同一である]。

【請求項12】
 
請求項11に記載のアダプターと、請求項11に記載のアダプターに含まれる制限酵素サイトXと同一の制限酵素サイトを含む二本鎖DNAからなるアダプターとを含む環状DNA作成用キットであって、該キットを用いて作成された環状DNA分子の集団から複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することを可能にする、キット。

【請求項13】
 
請求項1~3いずれかに記載の方法を用いるcDNAライブラリーの作成方法であって、該ライブラリーが、該ライブラリーから複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することが可能なものである、方法。

【請求項14】
 
請求項5記載の方法または請求項7~9いずれかに記載の方法を用いる、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみからなるcDNAライブラリーの作成方法。

【請求項15】
 
以下の工程を含む、環状DNA分子をメイトペア法に供することにより遺伝子を同定する方法:
1)請求項1~3いずれかに記載の方法によって作成された環状DNA分子の集団または請求項6もしくは10に記載の複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAにおける、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程、ここで、請求項1~3いずれかに記載の方法によって作成された環状DNA分子の集団を用いる場合には、当該工程の前に、当該工程と同時に、または当該工程の後に、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程をさらに含む;および、
2)工程1)で解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、該複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAに含まれる遺伝子を同定する工程。

【請求項16】
 
以下の工程を含む、環状DNA分子をメイトペア法に供することにより融合遺伝子を検出する方法:
1)請求項1~3いずれかに記載の方法によって作成された環状DNA分子の集団または請求項6もしくは10に記載の複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAにおける、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程、ここで、請求項1~3いずれかに記載の方法によって作成された環状DNA分子の集団を用いる場合には、当該工程の前に、当該工程と同時に、または当該工程の後に、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程をさらに含む;および、
2)工程1)で解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程、ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、該複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAに含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。

【請求項17】
 
アダプター(B)の両側に隣接する両側の配列が、既知融合遺伝子の両側の末端に対応する、請求項16に記載の融合遺伝子の検出方法

【請求項18】
 
アダプター(B)の両側に隣接する配列が、相異なる遺伝子の末端配列に対応し、かつ既知融合遺伝子の両側の末端には対応しないことにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子が新規融合遺伝子であると同定される請求項16に記載の方法
IPC(International Patent Classification)
F-term
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