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(In Japanese)遺伝子発現抑制用二本鎖核酸分子 meetings

Patent code P150012049
Posted date Jun 17, 2015
Application number P2013-541839
Patent number P6137484
Date of filing Nov 1, 2012
Date of registration May 12, 2017
International application number JP2012078348
International publication number WO2013065791
Date of international filing Nov 1, 2012
Date of international publication May 10, 2013
Priority data
  • P2011-241547 (Nov 2, 2011) JP
Inventor
  • (In Japanese)立花 亮
  • (In Japanese)田辺 利住
Applicant
  • (In Japanese)公立大学法人大阪
Title (In Japanese)遺伝子発現抑制用二本鎖核酸分子 meetings
Abstract (In Japanese)遺伝子サイレンシング機構を介した遺伝子発現抑制に関与する改良された二本鎖核酸分子及びその製造方法、並びに該二本鎖核酸分子を含む医薬組成物の提供。
18~28塩基長のアンチセンス鎖、及びアンチセンス鎖に対して十分に相補的な配列からなる相補的部分と、5'末端に2~100塩基長の一本鎖突出部分とを含む、センス鎖を含み、該相補的部分を介してセンス鎖とアンチセンス鎖が塩基対合する遺伝子発現抑制用二本鎖核酸分子、及びその製造方法、並びに該二本鎖核酸分子を有効成分として含有する医薬組成物。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

約20~30塩基長の小分子RNAが媒介する遺伝子発現抑制機構を遺伝子サイレンシングと呼ぶ。この機構は、酵母からヒトに至る様々な生物種において広く保存されており、発生、代謝及びウイルス感染防御等の多くの重要な生命現象の制御に関与していることが明らかになってきた。さらに、小分子RNAを利用して遺伝子サイレンシング機構により遺伝子発現をノックダウンさせるRNAi(RNA干渉)法が、現在、生物学の研究分野で必須の遺伝子機能解析ツールとしての地位を確立しつつある。また、こうした小分子RNAは、生体内の遺伝子又はウイルス等に対して発現抑制効果を示すため、次世代の核酸医薬品としても期待されている。

遺伝子サイレンシングを媒介する小分子RNAの一つとして、siRNA(small interfering RNA)がある。これは、例えば、外来の長い二本鎖RNA又はヘアピン構造のRNAからDicer酵素によりプロセシングされることによって生成される。生成されたsiRNA二本鎖のうち一方の鎖(アンチセンス鎖と称される)が、RISC(RNA-induced silencing complex)と呼ばれる複合体に取り込まれ、相補的な配列を持つ標的mRNAに結合し、標的mRNAの切断を誘導することによって配列特異的に遺伝子発現が抑制される。一方、細胞にはmiRNA(microRNA、マイクロRNA)と称される一群の機能性小分子RNAも存在する。miRNAは細胞内で元々発現される内在性小分子RNAであり、他の遺伝子発現を制御すると考えられている。miRNAは、ヘアピン構造を有する長い前駆体miRNAからDrosha酵素、次いでDicer酵素によるプロセシングによって生成される。生成されたmiRNA二本鎖のうち一方の鎖が、siRNAと同様にRISC複合体に取り込まれる。その後、配列が部分的に相補的な3'非翻訳領域を持つmRNAに結合し、タンパク質への翻訳を阻害すると考えられている(概説について、非特許文献1を参照のこと)。

遺伝子サイレンシングを媒介する小分子二本鎖RNAは、上述のようにDicer酵素によって生成されるため、一定の構造、すなわち約21~約24塩基の2本のRNAからなり、両鎖の3'末端に2塩基のオーバーハングを有する二本鎖RNAを形成する。そのため、一般に現在RNAi法で用いられるsiRNAも、3'末端に2塩基のオーバーハングを有する化学合成品である場合が多い。こうしたsiRNAの構造と活性との相関についてこれまでいくつかの研究がされてきた。例えば、Elbashirらは、3'又は5'末端に様々な長さのオーバーハングを有する各鎖21塩基長のsiRNA分子の活性を試験し、3'末端の2塩基オーバーハングが最も効率がよいことを確かめた(非特許文献2)。さらに、siRNAの一方の鎖又は両方の鎖を完全に2'-デオキシリボヌクレオチドに置換すると、RNAi活性は消滅するが、2塩基の3'オーバーハングのみを同様に置換してもRNAi活性に影響がないことを報告している(非特許文献2)。Sunらは、センス鎖を21塩基長の典型的なsiRNAより短くした非対称性二本鎖RNA(aiRNA)が有効なRNAi活性を有し、センス鎖によるオフターゲット効果が低減されることを示した(非特許文献3)。Bramsenらは、インタクトなアンチセンス鎖と、2つの短い(10~12塩基長)センス鎖からなる新たなsiRNA(sisiRNA)の設計を示した(非特許文献4)。sisiRNAは通常のsiRNAと同等の活性を有し、オフターゲット効果が低いとされている。これらの新規構造のsiRNA分子は、LNA(ロックド核酸)修飾等を有する場合もあり、もともと合成コストが高いRNAより、さらにコストが高く、実用的な用途には困難を伴う。また、siRNAの遺伝子発現抑制効果は配列デザインによって大きく左右され、その効果が不十分な場合が多い。そのような場合には、siRNAの用量を増やす必要があり、オフターゲット効果等の望ましくない効果の発現の可能性が高くなるという問題点があった。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、遺伝子サイレンシング機構を介した遺伝子発現抑制に関与する改良された二本鎖核酸分子及びその製造方法に関する。また本発明は、そのような二本鎖核酸分子を含む医薬組成物に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
二本鎖核酸分子を含む、遺伝子発現抑制剤であって、
該二本鎖核酸分子は、
18~28塩基長のアンチセンス鎖、及び
アンチセンス鎖に対して十分に相補的な配列からなる相補的部分と、5’末端に6~100塩基長の一本鎖突出部分とを含む、センス鎖
を含み、
該相補的部分を介してセンス鎖とアンチセンス鎖が塩基対合し、
該一本鎖突出部分は、その長さに基づいて40%~100%のG含量を有し、かつ、gna又はgnna(ここで各nは独立に任意の塩基である)からなるループ部分を有するヘアピン構造を形成せず、また、
該センス鎖の3’末端は、1塩基若しくは2塩基の突出末端、平滑末端、又は1塩基若しくは2塩基の陥凹末端である、遺伝子発現抑制剤

【請求項2】
 
アンチセンス鎖がリボヌクレオチドからなる、請求項1に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項3】
 
アンチセンス鎖がmiRNAである、請求項1又は2に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項4】
 
アンチセンス鎖が標的遺伝子の標的配列に対して十分に相補的な配列からなる、請求項1~3のいずれか1項に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項5】
 
センス鎖に含まれる相補的部分がリボヌクレオチドからなる、請求項1~4のいずれか1項に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項6】
 
センス鎖がリボヌクレオチドからなる、請求項1~5のいずれか1項に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項7】
 
センス鎖がデオキシリボヌクレオチドからなる、請求項1~4のいずれか1項に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項8】
 
一本鎖突出部分が1つ又は複数のGリッチな領域を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項9】
 
一本鎖突出部分が2重鎖、3重鎖又は4重鎖を形成する、請求項1~8のいずれか1項に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項10】
 
一本鎖突出部分が4重鎖を形成する、請求項9に記載の遺伝子発現抑制剤。

【請求項11】
 
センス鎖に含まれる相補的部分が、アンチセンス鎖に対して0~30%のミスマッチ塩基を有する、請求項1~10のいずれか1項に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項12】
 
請求項1~11のいずれか1項に記載の遺伝子発現抑制剤を製造する方法であって、
(a)標的遺伝子の標的配列に対して十分に相補的な配列を含むアンチセンス鎖を設計するか、又はmiRNAであるアンチセンス鎖を選択する工程、
(b)アンチセンス鎖に対して十分に相補的な配列からなる相補的部分と、5’末端に一本鎖突出部分とを含むセンス鎖を設計する工程、
(c)アンチセンス鎖及びセンス鎖を合成する工程、並びに
(d)合成されたアンチセンス鎖及びセンス鎖を塩基対合させる工程
を含む方法によって二本鎖核酸分子を製造し、該二本鎖核酸分子を含む遺伝発現抑制剤を調製することを含む、方法。

【請求項13】
 
請求項1~11のいずれか1項に記載の遺伝子発現抑制剤を含有する医薬組成物。

【請求項14】
 
製薬上許容可能な担体を含む、請求項13に記載の医薬組成物。

【請求項15】
 
アンチセンス鎖が、配列番号1に示す塩基配列を含む、請求項1に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項16】
 
センス鎖が、配列番号12、14、15、17及び47~59のいずれかに示す塩基配列を含む、請求項15に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項17】
 
センス鎖が、配列番号57に示す塩基配列を含む、請求項16に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項18】
 
アンチセンス鎖が、配列番号2に示す塩基配列を含む、請求項1に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項19】
 
センス鎖が、配列番号30、31、38~44、66、72~74及び76のいずれかに示す塩基配列を含む、請求項18に記載の遺伝子発現抑制剤

【請求項20】
 
センス鎖が、配列番号40に示す塩基配列を含む、請求項19に記載の遺伝子発現抑制剤
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2013541839thum.jpg
State of application right Registered


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