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ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ

国内特許コード	P150012272
掲載日	2015年9月4日
出願番号	特願2013-213459
公開番号	特開2015-073512
登録番号	特許第6300223号
出願日	平成25年10月11日(2013.10.11)
公開日	平成27年4月20日(2015.4.20)
登録日	平成30年3月9日(2018.3.9)
発明者	中村美紀子赤田倫治星田尚司
出願人	国立大学法人山口大学
発明の名称	ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ
発明の概要	【課題】本発明の課題は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流又は下流にシグナルペプチドやタグペプチド等をコードするＤＮＡ配列を簡易に付与することや、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を簡易に導入することができる、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを提供することにある。【解決手段】ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ、又はＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製する。また、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた配列を含む線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーであって、ターミネータのセンス鎖配列とプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列を順次備えたフォワードプライマーを作製する。【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要	様々なタンパク質を細胞内に発現させる技術は、細胞内におけるタンパク質の機能解析、工業・医療・農業分野で商業的に利用されるタンパク質の生産等に広く用いられており、今日では欠かせない技術である。細胞内で特定のタンパク質を発現させるためには、細胞内へタンパク質をコードする遺伝子を導入する方法が有用であり、導入する遺伝子等のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の運搬体としてプラスミドベクターを使用した方法が広く利用されている。一方、これまでに正確性の高いＤＮＡポリメラーゼが開発されたことから、ＰＣＲ法によりタンパク質をコードする遺伝子を数時間で合成することが可能になった。そこで、タンパク質をコードする遺伝子を含む線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入する方法も検討されている。この方法により、タンパク質の機能解析、タンパク質の生産、創薬のためのスクリーニング等の目的に応じて、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡが十分に発現すれば、従来の手間と時間のかかるプラスミド構築を、簡便で迅速なＰＣＲ法による線状二本鎖ＤＮＡの作製に替えることが可能となり、大幅な時間の短縮、ハイスループット化が期待できる。線状二本鎖ＤＮＡをそのまま細胞内に導入し、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる場合に用いる線状二本鎖ＤＮＡとしては、プロモータ配列、タンパク質をコードする遺伝子配列等のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列、ターミネータ配列を順次備える線状二本鎖ＤＮＡが用いられているが、細胞内でのＲＮＡの発現は簡便かつ十分なものではなかった。また、プロモータ配列、タンパク質をコードする遺伝子配列、発現マーカーをコードするＤＮＡ配列、ターミネータ配列、ポリアデニレーションシグナル配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により調製する方法が提案されているが（特許文献１参照）、各配列の両端に制限酵素サイト又はアニーリング配列をそれぞれ組み込み、ＰＣＲ法により該ＤＮＡ断片を構築し、次いでその５’末端にリン酸を付加するか制限酵素により突出末端を作製してセルフライゲーションにより環状化を行う必要がある等、作業が煩雑でかつ時間がかかるという問題があり、さらに、作製したＤＮＡ断片も、線状二本鎖ＤＮＡとしてではなく、環状化して動物細胞に導入するものであった。本発明者らは、ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列からなり、線状二本鎖ＤＮＡによる細胞におけるＲＮＡ発現用のリバースプライマーであって、前記ターミネータ配列が、３０～２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むリバースプライマーや、このプライマーを用いて、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と前記連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ法により作製し、これを細胞内に導入してＲＮＡを発現させることを提案した（特許文献２参照）。この特許文献２の手法により、複雑な操作を必要とせず、簡便かつ迅速にＲＮＡ発現用の線状二本鎖ＤＮＡを作製することができ、該線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入することにより、タンパク質の機能解析、タンパク質の生産、創薬のためのスクリーニング等の目的に応じて、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを簡便かつ十分に発現させることが可能となった。しかしながら、あくまでプロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えたものであるため、タンパク質にシグナルペプチド又はタグペプチドを付与する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とプロモータ配列又はターミネータ配列との間にシグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入する必要があり、作業が煩雑になるという問題が残っていた。さらに、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に対して変異を導入する場合にも、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流にプロモータ配列、下流にターミネータ配列を備えていることから、変異を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入する作業が煩雑になるという問題も残っていた。
産業上の利用分野	本発明は、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、該ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーに関する。
特許請求の範囲	【請求項1】以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡであって、前記ターミネータ配列が、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含み、前記プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモータ配列又はヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ配列である、前記ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。（ａ）ターミネータ配列と、プロモータ配列と、タンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ；（ｂ）タンパク質をコードする遺伝子配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ；【請求項2】プラスミドの複製開始点、又は薬剤耐性遺伝子を含まないことを特徴とする請求項１記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。【請求項3】（ａ）におけるタンパク質をコードする遺伝子配列の下流、又は、（ｂ）におけるタンパク質をコードする遺伝子配列の上流に、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を備えたことを特徴とする請求項１又は２記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。【請求項4】ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さが２００～５０００塩基であることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
国際特許分類(IPC)	C12N 15/09 組換えＤＮＡ技術 C12Q 1/68 核酸を含むもの
Fターム	4B024AA20 遺伝子工学基礎技術、その他 4B024CA04 ｃＤＮＡ 4B024CA20 その他 4B024DA02 動物細胞 4B024EA04 プラスミド 4B024FA02 プロモ－タ－、オペレ－タ－ 4B024FA07 タ－ミネ－タ－ 4B024FA10 マ－カ－ 4B024GA11 遺伝子、プラスミドの導入 4B063QA01 定量、存否確認（ＦＷ） 4B063QQ42 ＤＮＡ 4B063QQ52 ＲＮＡ 4B063QR32 ＤＮＡ 4B063QR55 プローブ 4B063QR62 プライマー 4B063QS16 電気泳動 4B063QS25 ＰＣＲ法
出願権利状態	登録

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発明の名称	LINEAR DOUBLE-STRANDED DNA FOR RNA EXPRESSION
発明の概要	PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a linear double-stranded DNA for RNA expression which enables easy addition of a DNA sequence encoding a signal peptide or a tag peptide upstream or downstream of a DNA sequence for RNA expression or enables easy introduction of mutation into the DNA sequence for RNA expression. SOLUTION: The linear double-stranded DNA for RNA expression of the invention is prepared to comprise a terminator sequence, a promoter sequence and a DNA sequence for RNA expression in this order, or a DNA sequence for RNA expression, a terminator sequence and a promoter sequence in this order. Also prepared is a forward primer for preparation of the linear double-stranded DNA for RNA expression of the invention, which primer comprises a DNA sequence of the terminator sense strand and a DNA sequence that forms a complementary pairing with the promoter sequence in this order.

発明の名称

LINEAR DOUBLE-STRANDED DNA FOR RNA EXPRESSION

発明の概要

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a linear double-stranded DNA for RNA expression which enables easy addition of a DNA sequence encoding a signal peptide or a tag peptide upstream or downstream of a DNA sequence for RNA expression or enables easy introduction of mutation into the DNA sequence for RNA expression.
SOLUTION: The linear double-stranded DNA for RNA expression of the invention is prepared to comprise a terminator sequence, a promoter sequence and a DNA sequence for RNA expression in this order, or a DNA sequence for RNA expression, a terminator sequence and a promoter sequence in this order. Also prepared is a forward primer for preparation of the linear double-stranded DNA for RNA expression of the invention, which primer comprises a DNA sequence of the terminator sense strand and a DNA sequence that forms a complementary pairing with the promoter sequence in this order.