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LINEAR DOUBLE-STRANDED DNA FOR EXPRESSION OF MUTANT RNA

Patent code P150012273
File No. S2013-1454-N0
Posted date Sep 4, 2015
Application number P2013-213509
Publication number P2015-073514A
Patent number P6273753
Date of filing Oct 11, 2013
Date of publication of application Apr 20, 2015
Date of registration Jan 19, 2018
Inventor
  • (In Japanese)中村 美紀子
  • (In Japanese)赤田 倫治
  • (In Japanese)星田 尚司
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山口大学
Title LINEAR DOUBLE-STRANDED DNA FOR EXPRESSION OF MUTANT RNA
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a linear double-stranded DNA for expression of mutant RNA, of which introduction into a cell without its circularization enables expression of mutant RNA in the cell.
SOLUTION: Prepared linear double-stranded DNA for expressing mutant RNA is one of the following DNAa, DNAb and DNAc, where DNAa comprises Sequence 1', a terminator sequence, a promoter sequence and Sequence 2, in this order; DNAb comprises Sequence 1, a terminator sequence, a promoter sequence and Sequence 2', in this order; and DNAc comprises Sequence 1', a terminator sequence, a promoter sequence and Sequence 2', in this order; wherein Sequence 1 corresponds to the downstream region of a DNA sequence for RNA expression, Sequence 1' is a sequence having a mutation at the 5' terminal region of Sequence 1, Sequence 2 corresponds to the upstream region of the DNA sequence for RNA expression, and Sequence 2' is a sequence having a mutation at the 3' terminal region of Sequence 2.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

様々なタンパク質を細胞内に発現させる技術は、細胞内におけるタンパク質の機能解析、工業・医療・農業分野で商業的に利用されるタンパク質の生産等に広く用いられており、今日では欠かせない技術である。

細胞内で特定のタンパク質を発現させるためには、細胞内へタンパク質をコードする遺伝子を導入する方法が有用である。導入する遺伝子の運搬体としてはプラスミドベクターを利用した方法が広く利用されてきたが、プラスミドベクターを利用せずに線状二本鎖DNAを利用する方法も開発されている。

また、タンパク質の機能を調べる場合には、タンパク質をコードする遺伝子の様々な位置に置換、欠損、挿入等の変異を導入し、変異を導入した遺伝子を細胞内に導入して変異タンパク質を発現させ、変異による影響を調べる変異解析が行われている。

タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入する方法としては、近年、PCR法を利用する方法が行われている。例えば、変異を導入しようとする位置よりも前方領域を増幅するためのプライマーセットのうち少なくとも一方のプライマーに変異の導入の目的配列が含まれるプライマーセット、及び、後方領域を増幅するためのプライマーセットのうち少なくとも一方のプライマーに変異の導入の目的配列が含まれるプライマーセットをそれぞれ用いて、目的遺伝子の前方領域と後方領域とをPCR法により増幅し、得られる前方領域の増幅断片と後方領域の増幅断片とを連結させる方法(特許文献1参照)が提案されている。

特許文献1記載の方法は、目的遺伝子に変異を有する線状二本鎖DNAを作製することが可能であるものの、作製した線状二本鎖DNAを用いて変異タンパク質を細胞内で発現させるには、ベクターに連結して環状化させる必要があった。

また、鋳型となる環状DNA、前記鋳型DNAにアニールし、5’末端側が互いに相補的な領域を有する少なくとも1組の変異導入用プライマー対、並びにDNAポリメラーゼからなる混合液を調製し、調製した混合物をPCRに供し、5’突出末端を有するDNA断片を含むPCR産物として増幅することを特徴とする部位特異的変異導入方法(特許文献2参照)が提案されている。

特許文献2に記載の方法は、DNA断片が5’突出末端を有するようにする必要があること、及び、二本鎖DNAが環状構造をとることができるようにするため、用いるプライマー対は互いに9~30塩基のオーバーラップ領域を設け、そのオーバーラップ領域に変異を導入する部位を存在させる必要があること等、プライマーの設計にあたって制約があった。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、環状化させることなくそのまま細胞内に導入するだけで、細胞内で変異RNAを発現させることが可能な変異RNA発現用線状二本鎖DNAに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
DNAを細胞内に導入し、前記DNAに対応するRNAが発現する形質転換細胞を製造する方法であって、前記細胞が哺乳動物細胞であり、前記DNAが以下の(a)~(c)のいずれか記載の変異RNAをコードする線状二本鎖DNAであることを特徴とする形質転換細胞の製造方法。
(a)RNAをコードするDNA配列内の上流領域を欠失した下流領域からなる配列1の5’末端領域に変異を有する配列1’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記RNAをコードするDNA配列内の上流領域からなる配列2とを順次備えた変異RNAをコードする線状二本鎖DNAa;
(b)前記配列1と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列2の3’末端領域に変異を有する配列2’とを順次備えた変異RNAをコードする線状二本鎖DNAb;(c)前記配列1’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列2’とを順次備えた変異RNAをコードする線状二本鎖DNAc;

【請求項2】
 
配列1の5’末端領域が、配列1の5’末端から50塩基以内の領域であり、かつ、配列2の3’末端領域が、配列2の3’末端から50塩基以内の領域であることを特徴とする請求項1記載の形質転換細胞の製造方法。

【請求項3】
 
ターミネータ配列が、シミアンウイルス40(SV40)のターミネータ配列であることを特徴とする請求項1又は2記載の形質転換細胞の製造方法。

【請求項4】
 
プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)のプロモータ配列であることを特徴とする請求項1~3のいずれか記載の形質転換細胞の製造方法。

【請求項5】
 
変異RNAをコードする線状二本鎖DNAが、プラスミドの複製開始点又は薬剤耐性遺伝子を含まないことを特徴とする請求項1~4のいずれか記載の形質転換細胞の製造方法。

【請求項6】
 
変異RNAをコードする線状二本鎖DNAの長さが200~3000塩基であることを特徴とする請求項1~5のいずれか記載の形質転換細胞の製造方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered


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