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METHOD FOR PRODUCING ETHANOLOGENIC YEAST WHICH HAS XYLOSE UTILIZATION ABILITY

Patent code P150012298
File No. S2014-0028-N0
Posted date Sep 9, 2015
Application number P2013-213277
Publication number P2015-073508A
Patent number P6210487
Date of filing Oct 11, 2013
Date of publication of application Apr 20, 2015
Date of registration Sep 22, 2017
Inventor
  • (In Japanese)山田 守
  • (In Japanese)スカンヤ ニチヨン
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山口大学
Title METHOD FOR PRODUCING ETHANOLOGENIC YEAST WHICH HAS XYLOSE UTILIZATION ABILITY
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing a yeast using xylose to produce ethanol with high efficiency, without using a gene recombinant technology.
SOLUTION: An ethanologenic yeast having xylose utilization ability comprising the following (a)-(c) is produced: (a) a step of aerobically culturing the yeast which belongs to Kluyveromyces with the culture medium containing 5-30 mM of an iron salt; (b) a step of isolating the iron-tolerant mutant of the yeast which is grown in the step (a); and (c) a step of selecting the iron-tolerant mutant of the yeast of which the ethanol concentration in the culture medium when culturing the iron-tolerant mutant of the yeast isolated in the step (b) with the culture medium containing xylose as a carbon source for 48 to 72 hours is 1.5 or more times of the ethanol concentration in the culture medium when culturing the yeast used for the culture of the step (a) for 48 to 72 hours.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

地球温暖化が世界中で問題となっている中、微生物が様々な原料から発酵生産するバイオエタノールが注目されている。バイオエタノールはバイオマスから生成した糖を発酵して生産されるエタノールであり、再生可能な自然エネルギーであること、及びその燃焼によって大気中の二酸化炭素量を増やさないことから、化石燃料、特にガソリンに代替する燃料としての将来性が期待されている。

現在、工業的なバイオエタノールの生産において、原料としてはサトウキビ、糖蜜等の糖質や、トウモロコシ、ジャガイモ、キャッサバ等のデンプンが用いられているため、食料や飼料の生産と競合するという問題が生じている。そこで、草本系や木質廃材等のリグノセルロース系バイオマスが次世代のバイオエタノール原料として着目されている。リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、リグニン等から構成される。これまでにリグノセルロース系バイオマスを原料としたエタノール生産についての研究が進められ、リグノセルロースを物理的、化学的処理により糖化してエタノールを生産する方法として、例えば、雑草を使用し、前記雑草を緩衝液に浸漬して当該緩衝液に電圧を印加することにより雑草の通電処理物を得る通電処理工程と、前記通電処理物を酵素により糖化物とする糖化工程と、前記糖化物を原料として酵母を添加してエタノール発酵を行う発酵工程とからなる処理方法(特許文献1参照)や、酵素糖化処理によって糖を製造し、さらにエタノール発酵によって糖からエタノールを製造する方法において、酵素糖化処理の前に、水酸化ナトリウム等の金属水酸化物のエタノール水溶液を用いて、リグノセルロース系バイオマスを蒸解処理することにより糖を製造することを特徴とする前処理方法(特許文献2参照)が報告されているが、リグノセルロースの物理的、化学的処理はコストや環境負荷の問題が解決しておらず、未だ実用化には至っていない。

リグノセルロースの約25%を占める五炭糖の一種であるキシロースをバイオエタノール生産の原料とすることができれば、リグノセルロース系バイオマス活用が拡大すると期待される。しかしながら、一般的なエタノール生産酵母であるサッカロマイセス・セレビシエはキシロース資化能を有さないため、サッカロマイセス・セレビシエを用いた場合、キシロースをエタノール生産の原料とすることができない。

近年、遺伝子組換え等によりキシロース資化能を付与した微生物、例えば、キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換し、キシロースを炭素源として利用する能力を付与された真菌宿主細胞(特許文献3参照)や、ADH1遺伝子及びADH4遺伝子を減弱化することで、キシロースからのエタノール収率を向上するように改変されたクルイベロマイセス属に属する変異体酵母(特許文献4参照)や、グリシン合成系タンパク質の遺伝子及び/又はメチオニン合成系タンパク質の遺伝子の発現機能を喪失させ、かつキシロース代謝酵素遺伝子を導入することで、キシロースの資化速度が上昇した微生物(特許文献5参照)が報告されている。

しかしながら、遺伝子組換え微生物は、自然界に存在しない微生物であるため、生態系への影響の関係上、遺伝子組換え微生物を用いてエタノール生産を行わせる場合には、エタノール生産を行った発酵タンクから遺伝子組換え微生物が絶対に漏出しないように、気密性の高い設備を用意する必要がある等、いわゆる生物学的封じ込めに関する多くの制約を生じる。さらに、漏出した場合に備えた付随装置も必要となると共に、発酵終了時には、完全に殺菌して廃棄しなければならない等のコスト高の要因となる。

また、本発明者らは、耐熱性エタノール生産株であるクルイベロマイセス・マルシアヌスDMKU3-1042を用い、炭素源として様々な五炭糖や六炭糖を用いてエタノール生産を検討したが、五炭糖のみを炭素源とするとエタノール生産性は非常に低いこと(非特許文献1参照)や、エタノールを生産可能な耐熱性細菌であるザイモモナス菌において高温等の酸化ストレスに対してシトクロムCペルオキシダーゼが関与していること(非特許文献2参照)を報告した。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、キシロース資化能を有するエタノール生産酵母を生産する方法や、かかる方法により得られたキシロース資化能を有するエタノール生産酵母を用いたエタノールの生産方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の工程(a)~(c)を備えたことを特徴とするキシロース資化能を有するエタノール生産酵母を生産する方法。
(a)鉄塩を5~30mM含有する培地でクルイベロマイセス・マルシアヌス(K.marxianus)を好気的に培養する工程;
(b)工程(a)において生育した鉄耐性変異クルイベロマイセス・マルシアヌスを単離する工程;
(c)キシロースを炭素源とした培地で、工程(b)において単離した鉄耐性変異クルイベロマイセス・マルシアヌスを48~72時間培養したときの培地中のエタノール濃度が、工程(a)の培養に用いたクルイベロマイセス・マルシアヌスを48~72時間培養したときの培地中のエタノール濃度の1.5倍以上である鉄耐性変異クルイベロマイセス・マルシアヌスを選抜する工程;

【請求項2】
 
工程(a)において、鉄塩が硫酸第一鉄又はその水和物であることを特徴とする請求項1記載のキシロース資化能を有するエタノール生産酵母を生産する方法。

【請求項3】
 
請求項1又は2記載の生産する方法により得られたキシロース資化能を有するエタノール生産酵母を、キシロースを炭素源として加えた培地で培養することを特徴とするエタノールの生産方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered


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