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IGY SPECIFIC BINDING PEPTIDE AND PURIFICATION METHOD OF IGY BY THE SAME

Patent code P150012299
File No. S2014-0001-N0
Posted date Sep 9, 2015
Application number P2013-212343
Publication number P2015-073488A
Patent number P6245688
Date of filing Oct 9, 2013
Date of publication of application Apr 20, 2015
Date of registration Nov 24, 2017
Inventor
  • (In Japanese)伊東 祐二
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人鹿児島大学
Title IGY SPECIFIC BINDING PEPTIDE AND PURIFICATION METHOD OF IGY BY THE SAME
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an IgY specific binding peptide.
SOLUTION: The invention provides a peptide which comprises an amino acid sequence consisting of 17 amino acid residues represented by the formula: (X1-3)-C-(X5)-W-(X7-11)-W-(X13)-C-(X15-17) (where X1 and X3 among X1-3, and X15-17 are any amino acid residue except a cysteine residue independently, X2 is any amino acid residue which may be a cysteine residue, C is a cysteine residue, X5 is an amino acid residue of T, D, V, S, or E, W is a tryptophan residue, X7-11 are amino acid sequences (S, T, R, or N)-(S, A, K, or R)-(I, A, V, T, or G)-(V, Y, T, R, or S)-(G or D), X13 is an amino acid residue of V, L, D, S, M, T, or R); forms a disulfide bond between cysteine residues at positions 4 and 14; and can bind to tri IgY. The invention also provides an analysis or purification method of IgY using the peptide.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

現在、臨床診断や研究用の試薬としての抗体は、マウスのモノクローナル抗体やウサギのポリクローナル抗体が多く使われており、大きな市場を持っている。一方、ニワトリのIgY抗体は、免疫による特異抗体作製方法の確立とともに、試験動物としてのコストの安さ、動物抗体との交差反応の低さに加え、卵黄から非侵襲的にIgYの抗体が精製できることがメリットとして注目され、試薬としての新しい抗体として期待されている。

卵黄からのIgYの精製法として、いくつかの方法が報告されてきた(非特許文献1)。卵黄には、不溶性のリン脂質やリポプロテインが多く含まれており、これらがアフィニティ精製の際の障害となるため、これをPEG、Pectinなどを使った沈殿法によって除くプロトコールが報告されている(非特許文献2)。市販のIgY精製キットも同様な原理を用いたものであり、現在、主なもので、Eggcellent (Thermo Pierce) と EGGstract (Promega)がよく使われている。最近、Sock Hwee Tanらは、plant gums pectinとκ-carrageenanを用いた沈殿法で、市販のものとも、純度や収量で劣らない精製プロトコールを報告した(非特許文献3)。しかし、このような方法においても、精製されるIgYの純度は50~80%程度であり、より高精製度のIgYの調製には、アフィニティカラムの使用が不可欠である。

しかしながら、例えば、ヒトIgGにおけるプロテインAのような、IgYを精製するための特異的なリガンドは、報告されておらず、精製用の合成リガンドが報告されているものの(非特許文献4、あるいはGE Healthcare社の2-mercaptopyridine固定化カラム:HiTrap IgY Purification HP)、精製されたIgY抗体の純度の観点からは、不十分(70%程度)と言わざるを得ない。

本発明者らは、これまで、T7ファージディスプレイシステムによって構築したランダムペプチドライブラリを用いて、ヒトIgGやヒトIgAに特異的に結合するペプチドを単離し、そのペプチドを固定化したアフィニティカラムを使った抗体の精製法を報告してきた(特許文献1、2)。

しかし、IgY結合ペプチドについては、これまで十分な報告がなかった。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、IgY特異的結合ペプチドに関する。

本発明はまた、該ペプチドによるIgYの精製法を提供する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
下記の式(I):
(X1-3)-C-(X5)-W-(X7-11)-W-(X13)-C-(X15-17) (I)
(式中、X1-3が、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列GVK、GTR、RCV、WIR、EWS、GTS、ATT、VNV及びGTWからなる群から選択され
Cはシステイン残基であり、
X5は、T、D、V、S又はEのアミノ酸残基であり、
Wは、トリプトファン残基であり、
X7-11は、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列SSIVD、SAAYG、TAVTG、TKVTG、RKTTG、NRGRG、TRGSG、RSGRG及びRRTSGからなる群から選択され
X13は、V、L、D、S、M、T又はRのアミノ酸残基であり、並びに、
X15-17は、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列VDM、YDY、RND、FAS、DRD、NTP、YSV、SKS及びGIGからなる群から選択される)によって表される、17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、4位のシステイン残基と14位のシステイン残基との間でジスルフィド結合を形成しており、並びに、トリIgYと結合可能であることを特徴とするペプチド。

【請求項2】
 
上記のX1-3が、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列GVK、GTR及びRCVからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載のペプチド。

【請求項3】
 
上記のX15-17は、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列VDM、YDY及びRNDからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1又は2に記載のペプチド。

【請求項4】
 
上記のX5は、T、D又はVであることを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載のペプチド。

【請求項5】
 
上記のX7-11は、N末端側からC末端側へのアミノ酸配列SSIVD、SAAYG、TAVTG及びTKVTGからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1~4のいずれか1項に記載のペプチド。

【請求項6】
 
上記のX13は、V、L又はDのアミノ酸残基であることを特徴とする、請求項1~5のいずれか1項に記載のペプチド。

【請求項7】
 
以下のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項1~6のいずれか1項に記載のペプチド。
GVKCTWSSIVDWVCVDM(配列番号1)
GTRCDWSAAYGWLCYDY(配列番号2)
RCVCVWTAVTGWDCRND(配列番号3)
WIRCDWTKVTGWVCFAS (配列番号4)
EWSCVWRKTTGWSCDRD (配列番号5)
GTSCSWNRGRGWMCNTP (配列番号6)
ATTCTWTRGSGWSCYSV (配列番号7)
VNVCEWRSGRGWTCSKS (配列番号8)
GTWCTWRRTSGWRCGIG (配列番号9)

【請求項8】
 
以下のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項7に記載のペプチド。
GVKCTWSSIVDWVCVDM(配列番号1)
GTRCDWSAAYGWLCYDY(配列番号2)
RCVCVWTAVTGWDCRND(配列番号3)

【請求項9】
 
標識が結合されている、請求項1~8のいずれか1項に記載のペプチド。

【請求項10】
 
請求項1~8のいずれか1項に記載のペプチドと連結されたタンパク質からなる融合タンパク質。

【請求項11】
 
請求項1~8のいずれか1項に記載のペプチドを固相に結合してなる固定化ペプチド。

【請求項12】
 
請求項1~8のいずれか1項に記載のペプチドをコードする核酸。

【請求項13】
 
請求項1~8のいずれか1項に記載のペプチド又は請求項11に記載の固定化ペプチドをトリIgYと結合させること、並びに、結合したIgYを遊離させてIgYを回収することを含む、トリIgYの精製方法。

【請求項14】
 
請求項1~8のいずれか1項に記載のペプチド又は請求項11に記載の固定化ペプチドにサンプル中のトリIgYを結合させ、結合したIgYを検出することを含む、トリIgYの検出方法。

【請求項15】
 
請求項1~8のいずれか1項に記載のペプチド又は請求項11に記載の固定化ペプチドの少なくとも1種を含む、トリIgYの分析又は精製のためのキット。

【請求項16】
 
請求項11に記載の固定化ペプチドを含有する、トリIgY分離用カラム。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2013212343thum.jpg
State of application right Registered
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