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COMPOSITION FOR DETERMINING EFFICACY OF NEURAMINIDASE ACTIVITY INHIBITOR, KIT AND USE THEREOF

Patent code P150012518
File No. (12075)
Posted date Nov 12, 2015
Application number P2014-001258
Publication number P2014-155485A
Patent number P6411740
Date of filing Jan 7, 2014
Date of publication of application Aug 28, 2014
Date of registration Oct 5, 2018
Priority data
  • P2013-004953 (Jan 15, 2013) JP
Inventor
  • (In Japanese)黒田 章夫
  • (In Japanese)石田 丈典
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人広島大学
Title COMPOSITION FOR DETERMINING EFFICACY OF NEURAMINIDASE ACTIVITY INHIBITOR, KIT AND USE THEREOF
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a technique developed to detect an influenza virus more highly sensitively than a conventional immunochromatography method and find whether the detected influenza virus is susceptible to a neuraminidase activity inhibitor or not.
SOLUTION: Provided is a technique in which a neuraminidase activity inhibitor is used in vitro in combination with N-acetylneuraminic acid-luciferin and luciferase to determine the efficacy of the neuraminidase activity inhibitor against a detected influenza virus.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

インフルエンザウイルスはコア蛋白質(核蛋白(NP蛋白)および膜蛋白(M1蛋白))の抗原性に基づき分類され、現在では、インフルエンザA、BおよびCの3つの型があることが明らかになっている。

A型インフルエンザウイルスは、さらに、ウイルス粒子の2種類の表面糖蛋白であるヘマグルチニン(Hemagglutinin(HA)、以下、適宜HAと略記する。)とノイラミニダーゼ(Neuraminidase(NA)、以下、適宜NAと略記する。)との抗原性に基づいて、HAでH1~H16、NAでN1~N9の亜型に分類される。HAは、ヒト等の細胞に吸着および侵入する際に、細胞表面に存在するシアル酸と結合して、インフルエンザウイルス粒子が細胞内に取り込まれるときの重要な役割を果たしている。一方、NAは、ウイルス粒子が感染後期に細胞表面から離れる際にシアル酸を切断する働きを有し、感染性を獲得するのに役立っている。

インフルエンザの確定診断のための技術には、ウイルス分離法、RT-PCR法等が用いられている。しかし、これらの方法は操作が煩雑でありかつ測定に時間を要するので迅速な診断に適していない。迅速かつ簡便な検査法として、ニトロセルロース等のメンブレンを用いたイムノクロマト法が近年用いられるようになっている。この技術は、検出対象に特異的に結合する固相(例えばメンブレン)と、検出対象(ウイルス粒子)と、検出対象に特異的に結合する標識物(標識化した抗体)との複合体を固相上に形成する方法である。検出対象と特異的に結合する抗体に、標識物として、酵素(例えばアルカリフォスファターゼ)、金属コロイド(例えば金コロイド)、着色ラテックス粒子等が結合されている。特許文献1には、イムノクロマト法に基づく技術が開示されており、この技術を用いたキットも市販されている。しかし、従来のイムノクロマト法の診断キットは、特異度が高いものの(98.2%)感度が低い(62.3%)(非特許文献1参照)。

ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスの増殖過程において、感染細胞からのインフルエンザウイルスの放出に必要である。従って、ノイラミニダーゼを阻害することにより、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。インフルエンザウイルスの新しい治療法としてノイラミニダーゼ活性阻害剤が注目されており、これまでにいくつかの化合物が開発されている。これまでに開発された薬剤としては、ザナミビル(商品名リレンザ)、オセルタミビル(商品名タミフル)、ペラミビル(商品名ラピアクタ)、ラニナミビル(登録商標イナビル)などがある。ノイラミニダーゼ活性阻害剤は、呼吸器部位における粘液中のウイルス感染を阻害し、早期治療に有効と考えられている。また、インフルエンザを検出するための、N-アセチルノイラミン酸誘導体を発光試薬として用いる検出法が知られている(特許文献2~4参照)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、インフルエンザウイルスを診断および治療する技術に関するものであり、より詳細には、ノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する技術に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
N-アセチルノイラミン酸-ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬ならびにN-アセチルノイラミン酸-ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬を、被験体サンプルとそれぞれインキュベートする工程;
インキュベートした後の第一の発光試薬からの第一の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程;
第一の発光量をコントロール発光量と比較する工程;
N-アセチルノイラミン酸-ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬を、被験体サンプルとインキュベートする工程;
インキュベートした後の第二の発光試薬からの第二の発光量を測定する工程;ならびに
第二の発光量を、前記第一の発光量および前記コントロール発光量と比較する工程
を包含し、
前記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択され、前記第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択され、且つ前記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤とは異なるものである、被検体サンプルにインフルエンザウイルスが含まれているか否かを判定するとともに、インフルエンザウイルスが含まれていると判定された場合、当該インフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する方法
ここで、上記インフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する方法とは、
(1)被検体サンプルに、第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤または第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤の何れかに対して耐性を持つインフルエンザウイルスが存在するのか、または
(2)被検体サンプルに、第一の阻害剤および第二の阻害剤の両方に対して感受性を持つインフルエンザウイルスが存在するのか、を判定する方法である。

【請求項2】
 
抗インフルエンザ抗体を、被験体サンプルと接触させる工程;
N-アセチルノイラミン酸-ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬ならびにN-アセチルノイラミン酸-ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬を、被験体サンプルと接触させた抗インフルエンザ抗体を含有する画分と、それぞれインキュベートする工程;
インキュベートした後の第一の発光試薬からの第一の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程;
第一の発光量をコントロール発光量と比較する工程;
N-アセチルノイラミン酸-ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬を、前記被験体サンプルと接触させた抗インフルエンザ抗体を含有する画分と、インキュベートする工程;
インキュベートした後の第二の発光試薬からの第二の発光量を測定する工程;ならびに
第二の発光量を、前記第一の発光量および前記コントロール発光量と比較する工程
を包含し、
前記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択され、前記第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択され、且つ前記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤とは異なるものである、被検体サンプルにインフルエンザウイルスが含まれているか否かを判定するとともに、インフルエンザウイルスが含まれていると判定された場合、当該インフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する方法
ここで、上記インフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する方法とは、
(1)被検体サンプルに、第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤または第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤の何れかに対して耐性を持つインフルエンザウイルスが存在するのか、または
(2)被検体サンプルに、第一の阻害剤および第二の阻害剤の両方に対して感受性を持つインフルエンザウイルスが存在するのか、を判定する方法である。

【請求項3】
 
前記ルシフェラーゼが、下記〔I〕、〔II〕または〔III〕のアミノ酸配列からなる、請求項1または2に記載の方法:
〔I〕配列番号1に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号1に示されるアミノ酸配列において下記(a)、(b)および(c)の少なくとも1つの置換が生じたアミノ酸配列:
(a)423位のイソロイシンの、ロイシン、メチオニンもしくはフェニルアラニンへの置換;
(b)436位のアスパラギン酸の、グリシン、アラニンもしくはセリンへの置換;または
(c)530位のロイシンの、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンへの置換、
〔II〕配列番号3に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号3に示されるアミノ酸配列において下記(d)、(e)および(f)の少なくとも1つの置換が生じたアミノ酸配列;
(d)425位のイソロイシンの、ロイシンへの置換;
(e)438位のアスパラギン酸の、グリシンへの置換;または
(f)532位のイソロイシンの、アルギニンへの置換、
〔III〕配列番号5に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号5に示されるアミノ酸配列において下記(g)、(h)および(i)の少なくとも1つの置換が生じたアミノ酸配列;
(g)425位のイソロイシンの、ロイシンへの置換;
(h)438位のアスパラギン酸の、グリシンへの置換;または
(i)532位のイソロイシンの、アルギニンへの置換。

【請求項4】
 
N-アセチルノイラミン酸-ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬と、N-アセチルノイラミン酸-ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬と、N-アセチルノイラミン酸-ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬とを備えており、
前記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択され、前記第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択され、且つ前記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤とは異なるものである、被検体サンプルにインフルエンザウイルスが含まれているか否かを判定するとともに、インフルエンザウイルスが含まれていると判定された場合、当該インフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するためのキット
ここで、上記インフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するためのキットとは、
(1)被検体サンプルに、第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤または第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤の何れかに対して耐性を持つインフルエンザウイルスが存在するのか、または
(2)被検体サンプルに、第一の阻害剤および第二の阻害剤の両方に対して感受性を持つインフルエンザウイルスが存在するのか、を判定するためのキットである。

【請求項5】
 
抗インフルエンザ抗体をさらに備えている、請求項4に記載のキット。

【請求項6】
 
N-アセチルノイラミン酸-ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬、N-アセチルノイラミン酸-ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬、ならびにN-アセチルノイラミン酸-ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬を、被験体サンプルとそれぞれインキュベートする工程;
インキュベートした後の第一の発光試薬からの第一の発光量、インキュベートした後の第二の発光試薬からの第二の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程;ならびに
第一の発光量、第二の発光量及びコントロール発光量をそれぞれ比較する工程を包含し、前記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択され、前記第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択され、且つ前記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤とは異なるものである、インフルエンザウイルスの検出方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered


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