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(In Japanese)角膜内皮細胞の製造方法

Patent code P150012543
File No. (S2012-0020-N0)
Posted date Nov 19, 2015
Application number P2013-537580
Patent number P6041270
Date of filing Oct 5, 2012
Date of registration Nov 18, 2016
International application number JP2012076048
International publication number WO2013051722
Date of international filing Oct 5, 2012
Date of international publication Apr 11, 2013
Priority data
  • P2011-222138 (Oct 6, 2011) JP
  • P2012-076080 (Mar 29, 2012) JP
Inventor
  • (In Japanese)榛村 重人
  • (In Japanese)羽藤 晋
  • (In Japanese)坪田 一男
  • (In Japanese)吉田 悟
Applicant
  • (In Japanese)学校法人慶應義塾
Title (In Japanese)角膜内皮細胞の製造方法
Abstract (In Japanese)本発明は、角膜内皮細胞、特に角膜実質またはiPS細胞由来の神経堤幹細胞から角膜内皮細胞を効率的に製造する方法の提供、幹細胞をより効率的に角膜内皮細胞へと分化誘導することによって角膜内皮細胞を多量に安定して製造する方法の提供、及び角膜内皮細胞を含む医薬の提供を目的とする。
幹細胞をGSK3阻害剤(好ましくはGSK3β阻害剤)及びレチノイン酸を含む分化誘導培地、好ましくは、TGFb2、インスリンおよびROCK阻害剤からなる群より選択される少なくとも1種をさらに含む分化誘導培地で培養する工程を含む、幹細胞から角膜内皮細胞を分化誘導する方法、等。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に達することで認識される。つまり、角膜は、生体が視覚情報を得る際に光が通る通路の前面に位置する。したがって、損傷等により角膜に濁りが生じることは、視覚機能に重大な影響を及ぼす。

角膜は、組織学的には、外表面側から、角膜上皮、角膜実質、及び角膜内皮の3層からなる構造を有する。角膜の透明性は、角膜内皮のNa,K-ATPaseによるNa能動輸送(ポンプ機能)とバリア機能(ZO-1等のタイトジャンクションタンパク質)により、含水率が一定に保たれることにより保持されている。

角膜内皮細胞の減少などの角膜内皮の損傷により、上記の角膜内皮細胞の機能が損なわれ、角膜実質部に浮腫が生じる。これは角膜の透明性の低下を招き、視力を低下させる。このような状態は、水疱性角膜症と呼ばれている。一方で、ヒトの角膜内皮細胞は、一度障害を受けると再生する能力をほとんど持たないことが知られている。従って、なんらかの傷害により角膜内皮細胞が減少した場合、その治療は角膜移植が有効な、場合によって唯一の手段となる。実際、角膜移植適応例の約半数は角膜内皮機能不全による水疱性角膜症が占める。

現在、角膜内皮損傷患者は、角膜の上皮、実質及び内皮の3層構造の全てを移植する全層角膜移植により処置されている。全層角膜移植は、確立された技術ではあるが、日本での角膜提供は不足しているのが現状であり、また、拒絶反応が問題となる。かかる問題点を解消するために、損傷を受けた組織のみを移植する「パーツ移植」が普及しつつある。角膜内皮を温存して、ドナーの上皮と実質のみを移植する深層層状角膜移植(Deep Lamellar Keratoplasty:DLKP)(非特許文献1および2)や内皮を含む一部の角膜だけを移植する角膜内皮移植(特許文献1および2、非特許文献3)等が知られている。しかしながら、例えば角膜内皮移植の場合、その移植材料の供給源となるのは依然として角膜内皮そのものであり、角膜の提供者が限られていることを鑑みれば、全層角膜移植同様、ドナー不足の問題点を克服することができない。さらに角膜内皮細胞は培養が難しく、移植に十分な数の培養細胞を調製することには時間的及び費用的な負担が大きい。

近年、マウス角膜実質より幹細胞の特徴をもつ細胞の分離が報告されている(非特許文献4)。神経堤由来であるこの幹細胞は分化誘導培地を用いることで神経細胞や脂肪細胞などにも分化する能力を有する。

組織幹細胞/前駆細胞を、TGFb2を添加した培地中で接着培養することにより、これらの細胞を角膜内皮細胞へと分化誘導し得ることが報告されているが(特許文献3)、角膜内皮細胞としての機能(例えばポンプ機能)の有無については示されていない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、幹細胞から角膜内皮細胞を製造する方法、幹細胞から角膜内皮細胞を分化誘導する方法に関する。さらに本発明は、該方法により得られた角膜内皮細胞、並びにそれを用いた医薬等に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
幹細胞を分化誘導培地で培養する工程を含む、幹細胞から角膜内皮細胞を製造する方法であって、該分化誘導培地が、ROCK阻害剤、GSK3阻害剤及びレチノイン酸を含むものであり、幹細胞が、iPS細胞由来神経堤幹細胞、角膜実質由来神経堤幹細胞又は皮膚由来多能性前駆細胞である、方法。

【請求項2】
 
さらに、TGFb2およびインスリンからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1記載の方法。

【請求項3】
 
該分化誘導培地が、分化誘導初期において、レチノイン酸、TGFb2およびROCK阻害剤を含み、分化誘導後期において、bFGF、GSK3阻害剤およびROCK阻害剤を含むものである、請求項2記載の方法。

【請求項4】
 
該分化誘導培地が、分化誘導初期において、ROCK阻害剤、GSK3阻害剤およびレチノイン酸を含み、分化誘導後期において、ROCK阻害剤を含むものである、請求項1又は2記載の方法。

【請求項5】
 
該分化誘導培地が、GSK3阻害剤、レチノイン酸、TGFb2、インスリンおよびROCK阻害剤を含むものである、請求項2記載の方法。

【請求項6】
 
GSK3阻害剤が、6-ブロモインジルビン-3’-オキシム(BIO)である、請求項1又は2記載の方法。

【請求項7】
 
ROCK阻害剤が、(+)-(R)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩(Y-27632)である、請求項1又は2記載の方法。

【請求項8】
 
レチノイン酸が、全トランス-レチノイン酸である、請求項1又は2記載の方法。

【請求項9】
 
該分化誘導培地が無血清培地である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。

【請求項10】
 
幹細胞を分化誘導培地で培養する工程を含む、幹細胞から角膜内皮細胞を分化誘導する方法であって、該分化誘導培地が、ROCK阻害剤、GSK3阻害剤及びレチノイン酸を含むものであり、幹細胞が、iPS細胞由来神経堤幹細胞、角膜実質由来神経堤幹細胞又は皮膚由来多能性前駆細胞である、方法。

【請求項11】
 
該分化誘導培地が、さらにTGFb2およびインスリンからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項10記載の方法。

【請求項12】
 
該分化誘導培地が、分化誘導初期において、レチノイン酸、TGFb2およびROCK阻害剤を含み、分化誘導後期において、bFGF、GSK3阻害剤およびROCK阻害剤を含むものである、請求項11記載の方法。

【請求項13】
 
該分化誘導培地が、分化誘導初期において、ROCK阻害剤、GSK3阻害剤およびレチノイン酸を含み、分化誘導後期において、ROCK阻害剤を含むものである、請求項10又は11記載の方法。

【請求項14】
 
該分化誘導培地が、GSK3阻害剤、レチノイン酸、TGFb2、インスリンおよびROCK阻害剤を含むものである、請求項11記載の方法。

【請求項15】
 
GSK3阻害剤が、6-ブロモインジルビン-3’-オキシム(BIO)である、請求項10又は11記載の方法。

【請求項16】
 
ROCK阻害剤が、(+)-(R)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩(Y-27632)である、請求項10又は11記載の方法。

【請求項17】
 
レチノイン酸が、全トランス-レチノイン酸である、請求項10又は11記載の方法。

【請求項18】
 
該分化誘導培地が無血清培地である、請求項1017のいずれか1項に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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